【实验技术及其应用】ELIS A与GIC A法检测新塱冠状病毒IgM及IgG的比较
彭孝斌，代学，沈燕
重庆市长寿区疾病预防控制中心，重庆401220
[摘要]目的通过ELISA与GICA检测新型冠状病毒IgM及IgG结果的比较，为基层实验室到一种简单有效的抗体检 测方法。方法将26例COVID-19确诊病例作为检测组,54例发热病人为对照组，采用ELISA与GICA检测新型冠状病 毒IgM及IgG，比较其敏感性、特异性及2种方法间的一致性。结果对于IgM，ELISA敏感性为65.38%，特异性为
88.89%; GICA敏感性为53.85%，特异性为98.15%，经KAPPA—致性检验2种方法中度一致；对于IgG，ELISA敏感性为
57.69%，特异性100%; GICA敏感性为84.62%，特异性100%;2种方法一致性较弱。结论在现有的试剂条件下，ELISA
未表现出优于GICA的性能，而GICA较ELISA操作更为简便快捷，是基层实验室的良好选择。同时，对于新试剂新方法，实验室应该做好方法评估及试剂验证，保证结果质量，更好地为防控疫情做出贡献。
[关键词]新型冠状病毒肺炎；抗体检测;IgM;IgG
[中图分类号]R446 [文献标识码]A [文章编号]1672-2116(2020)04-234-04
Preliminary Comparison of COVID-19 IgM and IgG
by ELISA and GICA
PENG Xiaobin, DAI Xue, SHEN Yan
Changshou District Center for Disease Control and Prevention，Chongqing401220, China.
Abstract Objective Preliminary comparison of COVID-19 IgM and IgG tested by ELISA and GICA methods,so that to find a simple and effective antibody detection method for basic laboratory.
Methods Total of 26 confirmed cases of COVID-19 were taken as the test group,and54 febrile patients were selected as the control group,compare the sensitivity,specificity and consistency of IgM and IgG by ELISA and GICA methods.Results The sensitivity of ELISA was 65.38%, specificity was88.89%；the sensitivity of GICA was53.85%, specificity was98.15%, and the two methods were moderately consistent by kappa consistency test；For IgG,the sensitivity of ELISA was
57.69%, specificity was100%；the sensitivity of GICA was84.62%, specificity was100%; the
consistency of the two methods was weak.Conclusion Under the existing reagent conditions,ELISA has no better performance than GICA,and GICA is more convenient and quick than ELISA,which is    a good choice for basic laboratory.At the same time,for the new reagent and new method,the laboratory should do a good job in method evaluation and reagent acceptance to ensure the quality of results and make a better contribution to the prevention and control of epidemic.
Key words COVID-19；antibody test；IgM；IgG
作者简介：彭孝斌（1985-)，男，本科，主管技师，微生物检验
通信作者：邓静（1986-)，女，本科，公卫主管医师，疾病预防控制，E-mail:****************
2019年12月底武汉市发现不明原因肺炎1，并 从患者标本中检出了一种新型冠状病毒>3]。2020 年2月7日国家卫生健康委员会决定将“新型冠状病 毒感染的肺炎”暂命名为“新型冠状病毒肺炎”\  2 月11日，WHO将这种疾病正式命名为C0VID-19 (corona virus disease-19):5，，世界各地均有病例及 死亡报告[6i。随着对疾病认识的不断加深，我国的 新型冠状病毒肺炎防控方案已更新到第6版7]。新 版方案中加人了血清抗体检测（胶体金、磁微粒化 学发光、ELISA)用作新型冠状病毒核酸检测阴性 病例的补充检测。本文以有限标本比较酶联免疫 吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA，下文简称酶联法）与胶体金免疫层析实验 (colloidal-gold immunochromatography assay,GICA，下文简称胶体金
法)检测新型冠状病毒肺炎IgM及 IgG的差异，为基层实验室选择抗体检测方法提供 参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1对象选择符合新型冠状病毒肺炎防控方案（第6版）定义的确诊病例作为检测组，共计26 例，年龄13 ~ 70岁，男性10例，女性16例e选择发 热门诊上报并排除新冠感染的发热病人为对照组，共计54例，年龄1 ~ 84岁，男性31例，女性23例。1.1.2标本用无添加剂的真空采血管采集上述对象的4 m l空腹静脉血，静置2 h，取血清4 t冷藏 暂存。
1.2方法
1.2.1酶联法检测I g M取10 nL血清+ 990叫样品稀释液混匀，严格按照试剂说明书操作，采用双 波长(450 nm/630 nm)测定OD值，按Cut-off=阴性 对照OD值+ 0.25计算（阴性对照小于0.1时按0.1计算），样品OD值< Cut-off为阴性，反之为阳性。1.2.2酶联法检测I g G取10叫血清+ 990 nL样 品稀释液混勻，严格按照试剂说明书操作，采用双 波长（450 nm/630 nm)测定O D值，按Cut-off=阴性 对照OD值+阳性对照OD值x〇.2计算(阴性对照小 于0.1时按0.1计算），样品OD值< Cut-off为阴性，反之为阳性。
1.2.3胶体金法检测IgM及I g G取10 pL血清分 别加人试剂条的IgM及IgG样本孔中，再分别加入 80 pL样
品稀释液，室温静置，15 min内观察结果。1.2.4仪器与试剂仪器采用Rayto RT-3100全自 动洗板机，Rayto RT-6100酶标分析仪。试剂包括 广州达瑞新型冠状病毒2019-nCoV IgM抗体检测 试剂盒（酶联法），广州达瑞新型冠状病毒2019- nCoV IgG抗体检测试剂盒（酶联法），英诺特生物 技术有限公司新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测 试剂盒(胶体金法）。
1.3统计分析采用SPSS18.0软件进行数据分 析，计数资料以百分比表示，用Fisher确切概率法进 行假设检验，以尸<0.05为差异有统计学意义。一致性分析用ATa/jpa检验，值< 0为一致性极 差，0~0.20 为微弱，0.21 ~ 0.40 为弱，0.41 ~ 0.60 为 中度,0.61 ~ 0.80为高度,0.81〜1.00为极强;8]。
2结果
2.1 IgM检测结果计算特异性得出，酶联法特异 性为88.89% (48/54 )、胶体金法特异性为98.15% (53/54)，差异无统计学意义(P= 0.113)；酶联法敏 感性为65.38%( 17/26)、胶体金法敏感性为5
3.85% (14/26)，差异无统计学意义(P= 0.573)(表1)。
表1检测组及对照组IgM检测结果
组别
酶联法胶体金法
阳性阴性阳性阴性
检测组17914 12
对照组648153
对两种方法检测结果的一致性进行比较，酶联 法与胶体金法阳性符合率为72.22%，阴性符合率为 61.54%，总符合率为 80.77%，A'a/jpa值=0.606，两种 方法具有中度的一致性(表2)。
表2两种方法检测IgM结果
酶联法
胶体金法
合计
阳性阴性
阳性13417
阴性189
合计141226
2.2 IgG检测结果两种检测方法特异性均为100%(54/54)；酶联法敏感性为 57.69%( 15/26)，胶
体金法敏感性为84.62%(22/26)，差异无统计学意 义(尸=0.064)(表 3)。
表3检测组及对照组IgG检测结果
组别
酶联法胶体金法
阳性阴性阳性阴性
检测组1511224
对照组054054
对两种方法检测结果的一致性进行比较，酶联 法与胶体金法阳性符合率为68.18%，阴性符合率为 36.37%，总符合率为73.08%，尺叩p a值=0.397,—致 性较弱(表4)。
表4两种方法检测IgG结果
酶联法
胶体金法
合计阳性阴性
阳性15015
阴性7411
合计22426
3讨论
自新型冠状病毒肺炎疫情爆发以来，防控方案 一直以基因测序或核酸检测等病原学检测结果为 确诊病例的唯一依据，其中基因测序成本高昂、操 作复杂、不易推广，因此实验室在实际工作中多采 用核酸检测。由于核酸检测过程环节多，操作复杂 耗时，影响因素多，标本采集运输不易等诸多不利 因素影响，其假阴性较多1^1，而抗体检测对发现核 酸检测持续阴性，但流行病调查及临床症状高度 怀疑病例的确诊有重要意义，再加上第六版防控 方案中也加人了血清学检测为确诊病例的实验室 依据[7 ，故而实验室迫切需要一种简单有效的血清 学检测手段。
酶联免疫吸附试验作为检测抗原或抗体的经 典实验，是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表 面，在其上进行酶标记的抗原抗体反应，用洗液洗 除未结合的游离成分，再加入显剂等最终形成黄 复合物从而检测出目标抗原或抗体的方法，一般 情况下具有敏感、成本低廉、易于标准化等优点。本文运用的IgM抗体检测试剂盒采用捕获法，以HRP标记的新型冠状病毒N蛋白（nucleocapsid protein)作为抗原，检测血清中的特异性丨gM;IgG抗 体检测试剂盒则采用间接法，用对人血清中新型冠 状病毒抗体具有高度特异性的基因工程重组抗原 包被反应板，检测血清中的特异性IgG：而胶体金 免疫层析实验是在还原剂的作用下将金盐还原成 大小均匀的金颗粒悬液，通过静电作用形成稳定的 胶体状态11，将其作为示踪物应用于抗原抗体检测 的方法，具有诊断简便快速，无需昂贵仪器，结果易 于判断的优点〜。本文运用的胶体金法抗体检测 试剂盒预包被胶体金标记的重组新型冠状病毒N 蛋白（nucleocapsid protein)和 S蛋白（spike glycoprotein)，采用免疫捕获原理检测血清中的特 异性IgM及IgG。
由于新型冠状病毒抗体检测暂无公认的金标 准，本文仅对2种方法的结果进行了比较：对于IgM 检测，2种方法的特异性及敏感性差异均无统计学 意义(P均>0.05)，同时具有中度的一致性(
值=0.6%)，但其敏感性均欠佳（酶联法为65.38%，胶体金法为53.85%)，提示2种方法可互相替换，但 不宜单独使用，以免造成漏检。对于IgG检测，2种 方法特异性均为100%，其敏感性差异无统计学意 义(尸> 0.05 )，但其阳性符合率68.18%，阴性符合率 为36.37%，总符合率为73.08%，&巧^值=0.397。由于Hsher确切概率法只能给出两种方法检出率的 差异是否具有统计学意义，但不区分其中的真阳 (阴）
性和假阳（阴）性的比例，虽然2种方法因未检 出假阳性而使得阳性符合率及总符合率较高，但酶 联法比胶体金法多检出7例假阴性，使阴性符合率 低，假阴性在总阴性中的比例高，故本文认为应采 信—致性检验结果13，认为2种方法一致性 较弱。值得注意的是，胶体金法检测IgG敏感性为 84.62%，特异性100%，足以满足实验室检验的需要，酶联法也未表现出优于胶体金法的性能。
实际工作中，基层实验室一般会面临人手紧缺、设备不足、任务繁重等困难，在无明显性能优势 的情况下，其更倾向于选择操作简便快速，无需额 外仪器的检测方法。而胶体金法只需在试剂条样 本孔加人血清标本，15 min内即可目视观察结果，不 需要特殊仪器设备，具有耗时短，操作简便，对实验 人员友好的优点，并且胶体金法检测新冠病毒IgM
和IgG的特异性很高，IgG检测试剂敏感性较高，亦 可同时分别检测IgM及IgG以提高检出率，足以作 为核酸检测的有力补充，满足检验的需要。因此，胶体金法是缺乏仪器、人员紧张的基层实验室的良 好选择。
本文中2种方法检测IgM的敏感性均较低，其 可能的原因是此次收集的血清多在病例恢复期采 集，而通常情况下,IgM产生较早、维持时间较短，病 例恢复期IgM可能已经消失或滴度降低到试剂检 出限以下而造成了漏检，总之抗体产生的规律值得 进一步研究。此外，抗体检测对于新冠病毒来说是 一个新的检测方法，相应检测试剂研发时间尚短，还需要进一步的优化改进，因此对于新试剂新方 法，建议实验室
更应做好细致的方法评估及试剂验 证，勿用过往经验主观判断方法的优劣，以此保证 结果质量，更好地为防控疫情做出贡献。
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