ＤＯＩ：
１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２０．１１．０９
·新型冠状病毒肺炎·
新型冠状病毒核酸检测模拟室内质控品的研制
    作者简介：杨传坤，１９８５年生，男，主管技师，硕士，从事临床分子生物学与免疫学检验工作。   
通信作者：
吴国球，博士研究生导师，教授，Ｅ ｍａｉｌ：ｎａｔｉｏｎｂａｌｌ＠１６３．ｃｏｍ；陈克平，硕士研究生导师，副主任技师，Ｅ ｍａｉｌ：ｋｅｐｉｎｇ２００１＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。
杨传坤１
，赵峰峰１
，吴国球１，２
，陈克平１，２
（１．东南大学附属中大医院检验科，南京２１０００９；
２．东南大学医学院检验系，
南京２１０００９）摘要：目的　评价用阴性临床样本稀释假病毒原料、制备新型冠状病毒核酸检测模拟室内质控品的可行性。方法　用ＰＢＳ与阴性临床样本梯度稀释噬菌体病毒样颗粒（假病毒）制备模拟室内质控品，用荧光ＰＣＲ仪检测ＯＲＦ１ａｂ和Ｎ靶基因。同时加入ＲＮａｓｅ抑制剂－２０℃保存，评价其稳定性。结果　ＰＢＳ与阴性临床样本稀释制备的模拟室内质控品核酸检测Ｃｔ值差异无统计学意义，且所用试剂Ｎ靶基因的检测灵敏度大于ＯＲＦ１ａｂ基因。制备的模拟质控品在－２０℃条件下可稳定保存６０ｄ，且无需添加ＲＮａｓｅ抑制剂。结论　阴性临床样本作为基质稀释假病毒原料制备模拟质控品可更好地反映基质效应，可用作新
冠病毒核酸检测室内质控品。同时应关注靶基因检测灵敏度不同造成的单靶标阳性样本，
防止漏检。关键词：新型冠状病毒；核酸检测；室内质控品；假病毒
中图分类号：
Ｒ４４６．６    文献标志码：Ａ 
新型冠状病毒（２０１９ ｎＣｏＶ，简称新冠病毒）可引起新型冠状病毒肺炎，此种病毒传播性强、传播迅
速，且人普遍易感［１］。早发现、
早确诊、早隔离是传染病防控的关键，新冠病毒核酸检测在疫情防控中扮演重要的角［２
］。国家卫生健康委员会发布的各版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》，均将核酸检测阳性作为新冠病毒感染确诊金标准。截至目前，国家药品监督管理局已经批准了约２０种采用实时荧光ＲＴ ＰＣＲ技术的新冠病毒核酸检测试剂。此技术灵敏度高、操作简便、成本较低，可在疾病早期或潜伏期内识别微量的病毒颗粒［３
］。受到疾病发展阶段、样本采集质量、样本运输保存条件、试剂耗材质量与操作人员水平等影响，核酸检测结果会产生“假阴性”与“假阳性”［４ ６
］。鉴于此，各类新冠病毒核酸检测实验室操作规范与专家共识均建议进行室内质控，持续监测核酸检测质量［７ ９
］。本研究利用国家卫生健康委员会临床检验中心的噬菌体病毒样颗粒样本，制备了更接近临床样本基质的新冠病毒模拟室内质控品，并初步评价其稳定性。同时，本研究对目前市场在售的新冠病毒核酸检
测室内质控品进行分析总结，方便实验室根据需要进行选择，做好新冠病毒传染防控的核酸检测工作。１　材料与方法１．１　
样本　新冠病毒核酸检测质控品原料［１０
］由国
家卫生健康委员会临床检验中心制备，
２０２０年４月申请获得。该原料为噬菌体病毒样颗粒（假病毒），
包装规格为０．５ｍＬ／支，
浓度为１０５
～１０６
ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ。低温运输，收到后放－８０℃保存。
１．２　仪器及试剂　ＢＧ Ｆｌｅｘ ４８全自动核酸提取仪（上海伯杰公司），Ａｎａｄａｓ９８５０全自动核酸提取及荧光ＰＣＲ分析系统（厦门安普利公司）；核酸提取及纯
化试剂、２０１９ ｎＣｏＶ核酸检测试剂盒（
上海伯杰公司），ＰＢＳ（上海生工公司），ＲＮａｓｅ抑制剂（南京诺唯赞公司）。１．３　方法
１．３．１　样本处理　根据国家卫生健康委员会临床检验中心推荐，用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ对新冠病毒质控
品原料进行梯度稀释，获得１∶２５、
１∶１２５、１∶６２５稀释的模拟质控品。每支２１０μＬ分装至１．５ｍＬ离心管
中（ＮＯＮＰＹＲＯＧＥＮＩＣ＆ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ／ＤＮａｓｅ ｆｒｅｅ）
。共获得１∶２５稀释度模拟质控品２０支，１∶１２５稀释度模拟质控品３０支，１∶６２５稀释度模拟质控品２０支。同时，用新冠病毒核酸检测阴性（Ｃｔ值＞３８）的口咽
拭子临床样本混合液代替ＰＢＳ稀释该质控品，
使该质控品获得与临床样本类似的基质，同样获得３个浓度梯度的模拟室内质控品。配制完成后取每个浓度的１０支质控品立即进行核酸检测。剩余的１∶１２５稀释度模拟质控品中，１０支加入ＲＮＡ酶抑制剂，
另１０支不加入ＲＮＡ酶抑制剂，
然后均置于－２０℃保存６０ｄ，使用前平衡至室温后立即进行检测。１．３．２　核酸提取　取出预分装提取试剂的９６孔核酸提取板，在生物安全柜内加入２００μＬ制备完成的模拟室内质控品，置于ＢＧ Ｆｌｅｘ ４８全自动核酸提取仪，加入磁套，选择自动化提取程序启动提取。提取获得的核酸立即进行检测。
１．３．３　核酸扩增　按２０１９ ｎＣｏＶ核酸检测试剂盒说明书配制２５μＬ反应体系，含核酸扩增反应液１２μＬ，酶混合液４μＬ，ＯＲＦ１ａｂ／Ｎ反应液（主要为引物与探针）４μＬ，核酸样本５μＬ。实时荧光ＲＴ ＰＣＲ扩增程序为：５０℃１０ｍｉｎ；９５℃５ｍｉｎ；９５℃１０ｓ，５５℃４０ｓ，４０个循环。在Ａｎａｄａｓ９８５０
全自动核酸提取及荧光ＰＣＲ分析系统进行扩增，检测新冠病毒ＯＲＦ１ａｂ及Ｎ靶基因。
１．３．４　结果分析　根据实际扩增曲线调节起止值，
进行分析，按上海伯杰试剂说明书中结果判读标准判断检测结果，确定模拟质控品靶基因ＯＲＦ１ａｂ及Ｎ的检测循环阈值（Ｃｔ）
值。１．４　统计学分析　用ＳＰＳＳ１３．０软件进行。正态分
布资料以均数±标准差（珋
ｘ±ｓ）表示，两组间均数比较用独立样本ｔ检验，两组间变异系数进行配对ｔ检验，多组间均数比较用单因素方差分析。以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。２　实验与结果２．１　不同稀释基质对模拟质控品靶基因检测影响
　用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ与阴性临床样本梯度稀释质控品原料，得到３个浓度的模拟质控品，实时荧光
ＲＴ ＰＣＲ检测结果显示，３种浓度质控品的Ｎ基因检测Ｃｔ值大于ＯＲＦ１ａｂ基因（约小３个Ｃｔ值）。当质控品进行１∶２５和１∶１２５稀释时，
ＰＢＳ与阴性临床样本梯度稀释质控品间ＯＲＦ１ａｂ和Ｎ靶基因检测Ｃｔ
值差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；而当质控品进行１∶６２５稀释时，ＰＢＳ与阴性临床样本梯度稀释质控品间ＯＲＦ１ａｂ和Ｎ靶基因检测Ｃｔ值差异有统计学意义，且阴性临床样本稀释效果优于ＰＢＳ稀释。见表１。
表１　
ＰＢＳ
与阴性样本梯度稀释质控品的靶基因检测Ｃｔ值（珋
ｘ±ｓ）浓度水平
靶基因ＰＢＳ
稀释阴性标本稀释
核酸检测结果阳性参考值阴性ｔ
值
Ｐ
值
１∶２５倍稀释ＯＲＦ１ａｂ基因２２．８４±０．３８２２．９９±０．１０１．２８０．２６Ｎ基因２０．１４±０．２９２０．２６±０．１０１．２６０．２３１∶１２５倍稀释ＯＲＦ１ａｂ基因２５．７６±０．２３２５．６７±０．４４０．５４０．６２Ｎ基因２２．６４±０．０９２２．３８±０．２９１．３２０．２０１∶６２５倍稀释
ＯＲＦ１ａｂ基因２８．１４±０．１９２７．８１±０．４０２．３１０．０３Ｎ基因
２４．６５±０．３５
２４．１２±０．６８
２．１９
０．０４
２．２　
模拟室内质控品稳定性评价　选择１∶１２５稀
释制备的质控品（接近新冠病毒核酸检测试剂检测下限１０３ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ）评价其稳定性。将最初配制的此浓度质控品分成２组，其中一组加入ＲＮａｓｅ抑制剂，另一组不加任何物质，两组均放入－２０℃冰箱保
存。６０ｄ后取出模拟质控品室温融化后立即进行
检测。以未冻存质控品检测结果作为基础数据。结果表明，冻存前后ＯＲＦ１ａｂ基因与Ｎ基因的检测
Ｃｔ值差异不具有统计学意义（Ｐ＞０．０５）
。未添加ＲＮａｓｅ抑制剂的模拟室内质控品未发生显著降解。见表２。
表２　模拟室内质控品的６０ｄ稳定性评价（珋
ｘ±ｓ）靶基因基础数据含ＲＮａｓｅ抑制剂无ＲＮａｓｅ抑制剂Ｆ
值
Ｐ
值
ＯＲＦ１ａｂ基因２５．６７±０．４４２５．５９±０．４８２５．６２±０．２５０．１０８０．９０Ｎ基因２２．３８±０．２９２２．４３±０．３９２２．４０±０．２７
０．４２０
０．３５
３　讨论
新冠病毒核酸检测试剂是在疫情暴发情况下研
发的临床检测试剂，大部分厂家无法获得大量临床样本进行检测试剂的性能验证。因此，进行严格的质量控制是非常必要的。本实验室相继参加上海临检中心（２０２０年２月）、国家卫生健康委员会临床检验中心（２０２０年３月）和江苏省临检中心（２０２０年６月）组织的新冠病毒核酸检测室间质评活动。同时，在疫情早期市场无可售相应室内质控品的情况下，本实验室从国家卫生健康委员会临床检验中心申请到噬菌体病毒样颗粒质控品原料进行室内质控。临检中心推荐使用ＰＢＳ配制室内质控品，但无
法反映基质效应。因此，本研究利用阴性临床样本
作为稀释液配制梯度浓度的室内质控品，并且对这种模拟质控品进行初步评价。本研究发现，用ＰＢＳ和阴性样本稀释质控品原料，
１∶２５和１∶１２５稀释时，ＯＲＦ１ａｂ和Ｎ靶基因检测Ｃｔ值差异无统计学意义，而１∶６２５稀释时，ＯＲＦ１ａｂ和Ｎ靶基因检测Ｃｔ值差异有统计学意义。质控品原料初始浓度为１０５
～１０６
ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ，１∶６２５稀释后浓度约为１６０～１６００ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ，而上海伯杰公
司新冠核酸检测试剂最低检测限为１０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ。因此，此稀释倍数制备的模拟室内质控品浓度在试剂检测限附近，检测得到的Ｃｔ值是不稳定的。同时，
阴性样本作为稀释基质制备的模拟质控品成分复杂，这些因素造成Ｃｔ值的标准差与ＣＶ值均大于
ＰＢＳ作为稀释基质时的标准差与ＣＶ值。但阴性样本稀释优于ＰＢＳ，Ｃｔ值小，检测灵敏度更高。因此，
本研究使用试剂检测下限２～５倍的浓度，即１∶１２５稀释得到的模拟室内质控品评价其稳定性。综上所述，本研究使用阴性临床样本作为基质制备模拟质控品是可行的；与ＰＢＳ相比，阴性样本稀释制备的质控品可更好反映基质效应程度，检测灵敏度甚至更好，但需要更深入的研究。
同时，３个浓度水平的模拟质控品Ｎ靶基因检测Ｃｔ值均大于ＯＲＦ１ａｂ，即２个靶基因的检出率存在差别。其他研究者用荧光ＲＴ ＰＣＲ检测新冠病毒也发现Ｎ基因的阳性率高于ＯＲＦ１ａｂ基因［５］。Ｃｈｕ等［１１］将研发的新冠核酸检测试剂检测临床阳性样本，发现Ｎ基因的灵敏度比ＯＲＦ１ａｂ基因高１０倍。这可能由于被感染细胞中的新冠病毒ｍＲＮＡ数倍于基因组ＲＮＡ，且新冠病毒不断转录新ｍＲＮＡ，这些ｍＲＮＡ均带有Ｎ基因，而仅带有少量ＯＲＦ１ａｂ基因，因此Ｎ基因阳性率高于ＯＲＦ１ａｂ基因［１２］。这种检出率差异也可能由于检测试剂对靶基因的检测灵敏度不同，以及Ｎ基因固有的保守性不如ＯＲＦ１ａｂ造成的核酸序列交叉，造成Ｎ基因检测假阳性［５，１
２］。本研究使用的质控品非临床样本，Ｎ基因和ＯＲＦ１ａｂ基因检测Ｃｔ值差异应该由检测试剂对靶基因的检测灵敏度不同而造成。因此，在进行新冠核酸检测时，应关注单靶基因阳性的临床样本，结果判断应结合试剂盒的靶基因检测灵敏度和患者临床症状，避免弱阳性样本的漏检。
制备的模拟质控品可以保存６０ｄ未发生显著降解，并且未加ＲＮａｓｅ抑制剂的模拟质控品稳定性不受显著影响。本研究制备模拟质控品后即冻存，使用时室温融化后立即检测。否则，考虑到阴性样本成分的复杂性，液态长期保存应该会影响质控品稳定性。但本研究使用的－２０℃冻存条件一般实验室均具备，因此具有可操作性。
目前，广州邦德盛、北京康彻思坦与郑州标源等生物公司研发、在售新冠病毒核酸检测的室内质控品，均以假病毒为原料制备。这些质控品价格昂贵，其室内质量的监控作用待市场反馈。本研究使用阴性样本稀释制备的模拟质控品更接近临床样本基质，可保持靶基因检测灵敏度，可长期稳定保存。新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点推荐试剂盒阳性质控品（阳性对照）使用假病毒作为原料［１３］，与本研究使用原料相同。在市售新冠病毒核酸检测室内质控品选择有限且价格昂贵，阳性临床样本难以获得的情况下，根据本研究利用阴性样本稀释试剂盒阳性对照制备模拟室内质控品，方法简单，成本低廉，可大量获得，可有效监测新冠病毒核酸检测质量。
４　参考文献
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（本文编辑：刘）

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