学术论著
核酸检测结果阳性参考值阴性中国医学装备2021年12月第18卷第12期 China Medical Equipment 2021 December V ol.18 No.12
*基金项目：国家传染病重大专项(2018ZX10711001-003)“重要病毒现场与实验室组合检测技术研究”①北京中医药大学东方医院检验科 北京 100071
②中国医学装备协会POCT装备技术分会青年委员会 北京 100078③军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所 北京 100078*通信作者：****************
作者简介：丁程伟，女，(1983- )，本科学历，主管技师，从事分子生物学检验研究工作。
[文章编号] 1672-8270(2021)12-0027-05 [中图分类号] R446.11+3 [文献标识码] A
Performance evaluation of 2019-nCoV nucleic acid detection reagents of one-step method and magnetic bead extraction method on different detection systems/DING Cheng-wei, XU Zhao-xia, SUN Kai-ming, et al//China Medical Equipment,2021,18(12):27-31.
[Abstract] Objective: To evaluate the performances of novel coronavirus (2019-nCoV) nucleic acid detection reagent of one-step method and magnetic bead extraction method on three different detection systems. Methods: Oral throat swab samples of clinical 2019-nCoV negative patients and reference materials of enterprises were selected to product samples with a certain of concentrations. The detection limit, positive and negative coincidence rate and precision of 2019-nCoV nucleic acid detection reagent of one-step method and magnetic bead extraction method were verified on polymerase chain reaction (PCR) instruments of three brands. Results: For the different detection system of three brands, the detection limits both of one-step method and magnetic bead extraction method were 100%, and the negative and positive coincidence rates of them were 100%, and the results of precision verification of them were less than 5%, which were within the acceptable range. And the performances of them were favorable. Conclusion: The performance parameters of 2019-nCoV nucleic acid detection reagent of one-step method and magnetic bead extraction method in the
detection systems of three brands can meet relevant standards, and they can be used in clinical detection work.
[Key words] Novel coronavirus (2019-nCoV); One-step method; Magnetic bead extraction method; Different systems; Performance verification
[First-author’s address] Clinical Laboratory, Dongfang Hospital Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100071, China.
[摘要] 目的：采用一步法及磁珠提取法新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂在3种不同检测系统上进行性能评价。方法：选用临床新型冠状病毒阴性患者口咽拭子样本及企业参考品制备成一定浓度的样本，采用一步法及磁珠提取法在3种品牌的聚合酶链反应(PCR)仪上对新型冠状病毒核酸检测试剂分别进行检出限、阴阳性符合率及精密度的验证。结果：一步法及磁珠提取法在3种品牌的不同检测系统上的检出限均为100%，阴阳性符合率均为100%，精密度验证结果均＜5%，在可接受范围内，且性能良好。结论：一步法及磁珠提取法新型冠状病毒核酸检测试剂在3种品牌检测系统上的性能参数符合相关标准，可以用于临床检测工作。
[关键词] 新型冠状病毒(2019-nCoV)；一步法；磁珠提取；多系统；性能验证DOI: 10.3969/J.ISSN.1672-8270.2021.12.008
丁程伟① 许朝霞① 孙凯明① 寿好长① 刘 鹏③ 张省委①②*
一步法及磁珠提取法新型冠状病毒核酸检测试剂
在多个检测系统的性能评价
*
国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》[1]中将实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，q-RT-PCR)和病毒基因测序结果作为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)病原学确诊证据，但由于测序技术对于人员和设备等要求较高，不易普及，因此核酸检测成为目前筛查新型冠状病毒(2019-nCoV)比较普遍的手段[2]。目前，已经过国家食品药品监督管理局批准的病毒核酸检测试剂盒有18个，其中荧光PCR检测试剂盒有10余种之多；而美国食品药品监督管理局(Food Drug Administration，FDA)已授权了
30余种核酸检测试剂[3]。北京中医药大学东方医院目前拥有一步法和磁珠提取法两种2019-nCoV核酸检测试剂，使用3种品牌的PCR仪检测病毒核酸，为保证
检测结果的准确可靠，提高筛查的准确率，本研究对不同方法的试剂在多个检测系统上进行性能评价。1 材料与方法1.1 仪器与试剂
(1)仪器设备。采用SLAN96P型PCR仪(中国湖南圣湘生物科技股份有限公司)；ABI7500型PCR仪(美国应用生物系统公司)；96E型PCR仪(中国西安天隆科技有限公司)；SSNP-9600A型核酸提取仪(中国江
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中国医学装备2021年12月第18卷第12期 一步法及磁珠提取法新型冠状病毒核酸检测试剂 在多个检测系统的性能评价*-丁程伟 等
苏硕世生物科技股份有限公司)；HR40-IIA2型生物安全柜(中国青岛海尔生物医疗股份有限公司)。
(2)试剂。磁珠提取法2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)购自上海伯杰医疗科技有限公司，批号：20201213B，检出限500 copies/ml；一步法2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)购自北京纳捷诊断试剂有限公司，批号：DJ202102，检出限200 copies/ml；核酸快速提取试剂盒(磁珠法批号：20201251)购自江苏硕世生物科技股份有限公司。两种试剂检测的靶基因均为N基因和ORF1ab基因。1.2 检出限验证方案 1.2.1 参考标准
根据中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS)发布的《分子诊断检验程序性能验证指南》(CNAS-GL039)[4]要求，使用定值标准物质的样本梯度稀释至厂家声明的检出限浓度，可重复测定5次或在不同批内对该浓度样本进行20次重复测定(如测定5 d，每日测定4份样本)。如果是5次重复检测，必须100%检出靶核酸；如果是20次检测，必须检出至少18次靶核酸。
1.2.2 2019-nCoV核酸检测试剂盒的验证方法
(1)磁珠提取法。将浓度为1.0×106 copies/ml的企业参考品稀释2 000倍至试剂盒检出限(500 copies/ml)，设置5个重复进行提取和扩增，要求总检出率为100%。
(2)一步法。2019-nCoV核酸检测试剂盒的验证方法对企业检出限参考品样本进行5次重复检测，要求阳性率为100%。
1.3 阴性及阳性符合率验证方案1.3.1 参考标准
根据《分子诊断检验程序性能验证指南》(CNAS-GL039)[4]要求，选取阴性样本至少5例、阳性样本(宜包含弱阳性、低扩增的样本)一般≥10例样本。要求阴性及阳性符合率均为100%。
根据国家医药行业标准《核酸扩增用检测试剂(盒)》(YY/T1182-2020)[3]对国家参考品或企业参考品中的
阴性参考品进行测定，检测结果应该为阴性；对国家参考品或企业参考品中的阳性参考品进行测定，检测结果应该为阳性。1.3.2 验证方法
选取北京中医药大学东方医院患者中的阴性样本5例
(1～5号)，弱阳性样本用企业参考品分别稀释至试剂检出限以及检出限的1.5、2.0、2.5、3.0倍(6～10号，共5份标本)，5份企业阳性参考品作为阳性样本(11～15号)。1.4 精密度验证方案1.4.1 参考标准
根据国家医药行业标准《核酸扩增用检测试剂(盒)》(YY/T1182-2020)[5]要求，批内精密度应满足如下要求：荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数(cycle threshold，Ct)值的变异系数(coefficient of variation，CV)≤5%，或对同一份样本平行测定10次的检测结果应一致。
1.4.2 2019-nCoV核酸检测试剂盒的验证方法
(1)磁珠提取法。将浓度为1.0×106 copies/ml的企业参考品稀释10倍至浓度为1.0×105 copies/ml，稀释1 000倍至浓度为1.0×103 copies/ml，将1.0×105 copies/ml和1.0×103 copies/ml两种浓度的样本(每种浓度10份)分别提取后进行扩增检测，计算批内精密度，要求CV≤5%。
(2)一步法。将浓度为1.0×105 copies/ml的企业检出限参考品稀释100倍至浓度为1.0×103 copies/ml，将1.0×105 copies/ml和1.0×103 copies/ml两种浓度水平的样本(每种浓度10份)分别直接进行检测，计算批
内精密度，要求CV≤5%。1.5 检测要求
检测人员严格按照基因扩增及2019-nCoV检测的相关文件进行实验操作和生物安全防护[6]。实验所用稀释液采用医院阴性患者咽拭子样本溶液混合制作而成，以实现与患者样本具有相同的基质。所有实验样本的检测流程与普通患者咽拭子的检测流程相同。1.6 评价指标
计算Ct值的均数±标准差和CV；计算阳性符合率与阴性符合率：阳性符合率=100%×[a÷(a+b+c)]，阴性符合率=100%×[d÷(b+c+d)]，其中a为试剂对阳性标本的检出个数，b为试剂对阳性标本的漏检个数，c为试剂对阴性标本的漏检个数，d为试剂对阴性标本的检出个数。2 结果
2.1 检出限验证结果
本研究分别在SLAN96P型、ABI 7500型和96E型3种品牌PCR仪上对一步法与磁珠提取法2019-nCoV 核酸检测试剂盒厂家声明的最低检出限进行了验证，重复进行5次检测，结果显示，所有样本内参合格，
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表1 三台PCR 仪一步法新型冠状病毒核酸检测试剂盒检出限结果(Ct 值)
检测批次
96E型
SLAN96P型
ABI7500型
结果判断
最低检出限(copies/ml)
ORF1ab基因
N基因ORF1ab基因
N基因ORF1ab基因
N基因阳性阴性134.95 35.05 32.3032.2034.6034.45≤39＞39200235.07 34.70 33.0433.2734.5434.34≤39＞39200334.84 35.22 33.1332.7934.3434.24≤39＞39200434.95 34.66 32.9932.4834.6534.35≤39＞39200536.00 34.39 32.9432.6134.6234.43≤39＞39200均值
35.16
34.80
32.88
32.67
34.55
34.36
≤39
＞39
200
表2 三台PCR 仪磁珠提取法新型冠状病毒核酸检测试剂盒检出限结果(Ct 值)
检测批次
96E型
SLAN96P型
ABI7500型
结果判断最低检出限(copies/mL)
ORF1ab基因
N基因ORF1ab基因
N基因ORF1ab基因
N基因阳性阴性133.2034.0534.1933.0935.6434.88≤38>38200233.1934.0034.1032.9735.6734.77≤38>38200333.0834.0133.2133.0335.4434.62≤38>38200432.8733.7733.4333.1835.7134.56≤38>38200532.9534.0133.8033.2335.8334.44≤38>38200均值
33.06
33.97
33.75
33.10
35.26
34.65
≤38
>38
200
表3 三台PCR 仪一步法新型冠状病毒核酸检测试剂盒阴性及阳性符合率验证结果(Ct 值)
样本编号
96E型
SLAN96P型
ABI7500型
结果判断
ORF1ab基因
N基因ORF1ab基因
N基因ORF1ab基因
N基因阳性阴性阴性1～5号
1
------≤39>392------≤39>393------≤39>394------≤39>395------≤39>39弱阳性6～10号
6
28.8129.0727.1227.1428.6228.67≤39>39729.1329.9628.1328.4228.7328.71≤39>39830.1130.2528.4129.4029.6429.62≤39>39930.2529.4129.1230.7630.7230.92≤39>391031.7731.7131.0731.0331.4531.73≤39>39阳性11～15号
11
22.3622.9320.4220.3121.7222.31≤39>391222.4622.6820.4220.2221.7522.26≤39>391322.2522.8620.3920.1222.1422.59≤39>391422.4122.4920.3720.0721.9022.43≤39>3915
22.54
23.40
20.40
20.18
21.73
22.25
≤39
>39
注：表中“－”为无Ct 值
ORF1ab与N基因的结果均为阳性，阳性率为100%，Ct值均＜38，见表1和表2。2.2 阴性及阳性符合率验证结果
选用阴性(1～5号)、弱阳性(6～10号)及阳性(11～15号)样本各5例分别在SLAN96P型、ABI 7500型和96E型3台PCR仪上对一步法与磁珠提取法2019-nCoV核酸检测试剂盒进行阴性及阳性符合率验证，结果显示，所有样本内参合格，ORF1ab基因与N基因的符合率均为100%，阴性均无Ct值，弱阳性、阳性Ct值均＜38，见表3和表4。
2.3 精密度验证结果
使用一步法和磁珠提取法新型冠状病毒核酸检测试剂盒在SLAN96P型、ABI7500型和96E型3台PCR仪上对不同浓度的样本进行检测及精密度验证，结果显示，所有样本内参合格，ORF1ab与N基因的CV均＜5%，最大CV仅为2.37，性能良好。96E 型、SLAN96P型及ABI7500型3个厂家的PCR仪一步法检测ORF1ab基因的弱阳性和阳性值的CV均小于磁珠提取法，而检测N基因的结果无明显差异，见表5和表6。
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表4 三台PCR 仪磁珠提取法新型冠状病毒核酸检测试剂盒阴性及阳性符合率验证结果(Ct 值)
样本编号
96E型
SLAN96P型
ABI7500型
结果判断ORF1ab基因
N基因ORF1ab基因
N基因ORF1ab基因
N基因阳性阴性阴性1～5号
1
------≤38>382------≤38>383------≤38>384------≤38>385------≤38>38弱阳性6～10号
6
30.1431.0930.5530.2232.1431.50≤38>38732.5530.8331.1430.2832.1031.43≤38>38832.8831.6430.7830.3132.9731.88≤38>38932.7330.8631.9031.3033.3632.50≤38>381033.8632.6932.1232.1433.1432.38≤38>38阳性11～15号
11
25.0424.1023.6523.3525.6224.94≤38>381224.8624.1623.7623.2825.3224.02≤38>381325.2724.1124.0323.1925.4524.09≤38>381425.1823.9325.5823.1325.7324.06≤38>3815
25.71
24.11
23.73
23.15
25.89
24.18
≤38
>38
注：表中“-”为无Ct 值
表5 一步法新型冠状病毒核酸检测试剂盒精密度验证结果
检测设备ORF1ab基因
N基因弱阳性CV(%)阳性CV(%)弱阳性CV(%)
阳性CV(%)天隆96E型29.08±0.170.5822.41±0.090.4029.43±0.45 1.5322.73±0.45 1.98SLAN96P型27.15±0.100.3720.40±0.030.1527.07±0.210.7820.27±0.23 1.13ABI7500型
28.53±0.14
0.49
21.80±0.14
0.64
28.72±0.08
0.28
22.32±0.12
0.54
注：表中CV 为变异系数
表6 磁珠提取法新型冠状病毒核酸检测试剂盒精密度验证结果
检测设备ORF1ab基因
N基因弱阳性CV(%)阳性CV(%)弱阳性CV(%)
阳性CV(%)天隆96E型32.08±0.76 2.3725.40±0.49 1.9330.63±0.33 1.0824.09±0.090.37SLAN96P型30.94±0.32 1.0324.28±0.60 2.4730.19±0.120.4023.17±0.100.43ABI7500型
32.43±0.38
1.17
25.54±0.19
0.74
31.37±0.42
1.34
24.36±0.38
1.56
注：表中CV 为变异系数
3 讨论
突发公共卫生事件的核酸检测是一种有效的筛查手段，在疫情防控中发挥了重要的作用。q-RT-PCR技术作为一项先进的临床检测技术，具有较高的灵敏度和特异度，但同时影响因素也很多。2019-nCoV是一种RNA病毒，极容易被环境中的RNA酶降解，因此在操作中对检测人员及环境的要求比较高。荧光定量PCR仪的性能和配套试剂质量的好坏直接关系到实验结果的准确性，对其进行性能验证具有重要的意义[7-9]。因此，临床实验室有必要对所用的检测试剂、检测系统进行性能评估，以保证结果的可靠性。
本研究参照CNAS-GL039《分子诊断检验程序
性能验证指南》[4]及《YY/T1182-2020核酸扩增用检测试剂(盒)》[5]的要求及参考PCR检测系统的性能评价方案[10-12]的相关报道，对在用的一步法与磁珠提取法新冠病毒核酸检测试剂分别在3种不同品牌的PCR仪上面进行检出限、阴性及阳性符合率以及精密度的验证。由于缺少临床阳性样本，其所用样本由临床患者阴性样本、厂家参考品组成。操作过程严格遵守试剂说明书的规定，并且与临床样本同时进行检测，其中检出限的符合率及阴性、弱阳性及阳性符合率均达到100%，符合国家规定的检测标准。
精密度是指一定条件下多次测定结果之间彼此符合的程度[13]。本研究对不同试剂在不同检测系统上进行精密度分析，结果显示CV均＜5%，符合参考标准的要求。但是，发现同
中国医学装备2021年12月第18卷第12期 一步法及磁珠提取法新型冠状病毒核酸检测试剂 在多个检测系统的性能评价*-丁程伟 等
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一种试剂在不同PCR仪上的存在着一定的差别，不同试剂在不同设备上检测阳性和弱阳性样本的ORF1ab 基因和N基因的CV在0.35～2.37之间波动，一步法试剂在3种不同品牌PCR设备上检测ORF1a
b基因的CV 均小于磁珠提取法，表明一步法检测ORF1ab基因精密度较高，N基因在3种不同品牌PCR设备上检测结果的CV差别无明显趋势。一步法和磁珠提取法试剂盒在3台不同PCR设备上检测性能都满足标准，不同检测系统之间使用同一试剂盒性能也都满足标准，本研究使用的一步法和磁珠提取法检测试剂盒和3种不同品牌PCR仪的检测系统整体性能差别不大。同一试剂在不同检测系统上的CV值存在一定波动，可能与仪器的温控系统以及荧光检测系统差异有关，需要在今后的工作中密切关注，阶段性地进行回顾性分析。此外，q-RT-PCR技术自动化程度较低，手工操作环节较多，有必要对不同操作人员之间进行结果的比对，故计划逐步纳入性能验证程序中。由于研究中只对试剂的某一批号进行了评估，且未收集到患者阳性样本进行评估，因此存在一定的局限性。实验室应严格按照标准规程操作并且严格质量控制，避免由于操作不当引起假阳性或者假阴性结果。4 结论
本研究分别在3台不同品牌的PCR仪器上对一步法和磁珠提取法的2019-nCoV新冠检测试剂进行了性能评估，结果显示两种试剂均符合国家标准，能够满足实验室检测需要，所用的新型冠状肺炎病毒检测系统的性能参数符合标准，可以为临床提供可靠的检测结果。
收稿日期：2021-03-18
国家卫生健康委办公厅，国家中医药管理局办公室.关于印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)的通知：国卫办医函〔2020〕184号[EB/OL].(2020-03-03)[2021-01-22].v/zhengce/zheng
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