三种新冠病毒核酸提取方法的效果评价
【摘要】 目的 通过比较三种核酸提取方法，了解不同新冠病毒核酸提取方法的性能。方法采用核酸释放剂法、磁珠法和离心吸附柱法对10份浓度为500copies/ml的新冠病毒阳性质控品和58例新冠病毒核酸检测双阳性的鼻咽拭子样本进行核酸提取，提取后的核酸在同一品牌的荧光定量PCR扩增仪上，使用同一品牌的新冠病毒核酸扩增试剂进行RT-PCR扩增，对三种新冠病毒核酸提取方法的效果进行比较。结果 试验结果显示,离心吸附柱法核酸提取效率最高，磁珠法次之，核酸释放剂法最低。 结论 离心吸附柱法提取核酸的效果最好，但操作繁琐、耗时，适合对阳性结果的复核。其次是磁珠法，既可以满足临床要求，又可以实现自动提取，适合于大样本的检测。核酸释放法虽然节省了核酸提取步骤和操作时间，但在三种方法中核酸提取的效率最低。
关键词：新型冠状病毒；核酸提取；实时荧光定量PCR
Evaluation of three methods for extracting COVID-19 nucleic acid
LIANG Qihe，LIANG Wanzhen，LIU Jianting
（Clinical laboratory of Jiangmen Central Hospital，Jiangmen 529070，China）
[abstract] Objective to investigate the performance of different COVID-19 nucleic acid extraction methods by comparing three nucleic acids extraction methods. Methods nucleic acids from 10 positive COVID-19 QC samples with 500copies/ml concentration and 58 positive coronavirus nasopharyngeal swab samples were extracted by nucleic releaser，magnetic bead method and spin column method. The extracted nucleic acids were amplified by RT-PCR using the same COVID-19 nucleic acid amplification reagent on the same fluorescent quantitative PCR analyzer,The effects of three COVID-19 nucleic acid extraction methods were compared. Results The test results showed that the spin column method had the highest extraction efficiency，followed by magnetic bead method, and the extraction efficiency of nucleic releaser was the lowest. Conclusion The spin column method has the best performance for nucleic acid extraction, but it is tedious and time-consuming and suitable for the reexamination of positive patients. The second is the magnetic bead method, which can both meet the clinical requirements and realize automatic extraction, suitable for the detection of large samples.Nucleic releaser although s
aving nucleic acid extraction steps and operating time, the efficiency of nucleic acid extraction was the lowest among the three methods.
[Keywords] 2019 novel Coronavirus； nucleic acid extraction；Real-time fluorescence quantitative PCR
2019年12月以来，在中国武汉爆发、流行的肺炎被中国科学家发现，该致病菌可以引起新型冠状病毒肺炎[1]。2020年2月国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组将该病毒命名为SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)，世界卫生组织将新冠病毒引起的疾病命名为COVID-19(Corona Virus Disease 2019[2]。
目前检测新冠病毒的方法主要是抗体和病毒核酸检测，病毒核酸检测为金标准，抗体还是辅助诊断手段[3-5]。新冠病毒检测的主要步骤为核酸提取、RT-PCR扩增。核酸提取的质量成为核酸检测质量的前提和保障，目前核酸提取的方法有磁珠提取、柱提取和核酸释放方法，由于提取核酸方法的原理、步骤、影响因素等导致核酸提取的效率也不同，本文拟通过对三种不同的核酸提取方法进行比较分析，综合评价不同的核酸提取方法对核酸检测结果的影响，为医院实验室等核酸检测机构选择适宜的核酸提取方法提供参考依据。
1材料与方法
1.1试剂与设备
核酸释放剂法、磁珠法和离心吸附柱法核酸提取试剂均为市场上公开销售的产品，新冠病毒核酸扩增试剂购自中山大学达安基因股份有限公司， 2019新型冠状病毒核糖核酸液体质控品购自广州邦德盛生物科技有限公司，西安天隆科技有限公司GeneRotex全自动核酸提取仪，美国应用生物系统公司7500荧光定量PCR分析仪。
核酸检测结果多久出1.2样本来源
样本来自本院输入的新冠病毒核酸检测双阳性的住院病人16例，其中男11人，女5人，年龄在26-45岁，住院隔离期间共收集鼻咽拭子样本58份。
1.3 新冠病毒核酸提取方法
将新冠核酸质控品和病人样本用三种不同核酸提取方法按照各自核酸提取试剂的使用说明书要求进行新冠核酸提取。
1.4结果判断
采用三种核酸提取方法进行核酸提取，按照新冠核酸扩增试剂盒使用说明书要求设置荧光定量PCR分析仪的仪器参数，配制RT-PCR扩增反应体系，把三种核酸提取方法提取的核酸加入到反应体系中进行RT-PCR扩增，按照试剂说明书的要求判断检验结果，若ORF1ab及N基因Ct＜40，结果判为阳性，若仅有单个基因Ct＜40,结果判为单基因阳性，若ORF1ab和N基因的Ct＞40，结果判为阴性。
1.5统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行数据处理和统计分析，采用配对t检验，P＜0.05差异具有显著统计学意义
2 结果
2.1新冠病毒核酸不同提取方法比较
2.1.1敏感度分析
RT-PCR扩增结果的Ct值可以反映核酸提取的模板浓度，而核酸浓度较低的标本提取结果更
能反映出方法的性能。实验室中取平均浓度为1.44E+03copies/mL的质控品用阴性稀释液稀释至500copies/mL，按照使用说明书要求用三种核酸提取方法进行核酸提取，然后在ABI7500型实时荧光定量PCR仪上使用同一种扩增试剂和扩增的条件，分别进行实时荧光定量RT-PCR扩增，记录Ct值。同一标本的上样量要一致，以保证样本均质性。提取后的核酸扩增结果见表1和表2。
表1 三种核酸提取方法提取质控品核酸后检测N基因的Ct值结果比较
提取方法 标本数 Ct（x±s）
释放剂法 10 38.16±2.15
磁珠法 10 36.32±1.43
离心吸附柱法 10 36.15±1.80
释放剂法与磁珠法相比较，P= 0.005＜0.05，Ct值差异具有统计学意义，释放剂与离心吸附柱比较，P=0.032 ＜0.05， Ct值差异具有统计学意义。磁珠法与离心吸附柱比较，P=0.676＞0.05， Ct值差异无统计学意义。
表2 三种核酸提取方法提取质控品核酸后检测ORF1ab基因的Ct值结果比较
提取方法 标本数 Ct (x±s)
释放剂法 10 38.71± 2.82
磁珠法 10 36.53±1.39
离心吸附柱法 10 35.84±1.74
释放剂法与磁珠法相比较，P =0.003＜0.05，Ct值差异具有统计学意义，释放剂与离心吸附柱比较，P= 0.01＜0.05 ，Ct值差异具有统计学意义，磁珠法与离心吸附柱比较，P= 0.092 ＞0.05， Ct值差异无统计学意义。
2.1.2临床标本阳性检出率比较
利用三种核酸提取方法对58例新冠病毒核酸检测双阳性鼻咽拭子标本、阳性对照、阴性对照和第三方质控品进行核酸提取，然后在ABI7500型实时荧光定量PCR仪上使用同一种扩增试剂和扩增的条件，分别进行实时荧光定量RT-PCR扩增，在确定阴阳对照、质控品以及标本
内标的检测结果的Ct值在预期值范围后，进行检测结果判定。实验结果显示，离心吸附柱法的双阳性标本数量为56份，单阳标本数量为2份，无阴性检测结果；磁珠法的核酸检测双阳性标本数量为54份，单阳性标本3份，阴性标本1份；稀释剂法仅有50例核酸检测双阳性，单阳性标本数量为2份，检测阴性的标本为6例，结果见表3。
表3三种核酸提取方法检测效果比较
双阳 单阳 阴性
原理
数量 百分率（%） 数量 百分率（%） 数量 百分率（%）
释放剂法 50 86.21 2 3.45 6 10.34
磁珠法 54 93.10 3 5.17 1 1.72
离心吸附柱法 56 96.55 2 3.45 0 0
3讨论
核酸检测是临床分子生物学实验室研究的基本手段，高质量的核酸提取是后续相关分子检测试验成功的关键。目前核酸提取的方法主要有核酸释放剂方法、磁珠提取方法和离心吸附柱提取方法。离心吸附柱提取方法是利用特异性物质吸附核酸，然后去除杂质，洗脱，获得纯净核酸，该方法步骤较多，操作者要求高。磁珠提取方法原理是利用磁珠在高盐低PH条件下吸附核酸，低盐高PH条件下与核酸分离的原理，在通过移动磁珠或转移液体来实现整个提取纯化过程，可以实现全自动化，比手工柱提取更为高效快捷。核酸释放剂的原理是利用有机溶剂，胍盐和表面活性剂对病毒的蛋白质结构变形，灭活，通过震荡和浸泡，使标本中的RNA释放出来，直接作为PCR模板进行扩增，无需加热或其他核酸提取操作[6]。

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