华蟾素联合紫杉醇对骨肉瘤U 2OS 细胞抑制作用的研究
马秀才1李晶2马晓燕1罗国栋1王建澍2绽春蕊1俞永智1宋建民1
1.甘肃省人民医院，甘肃兰州730000；
2.甘肃省肿瘤医院，甘肃兰州730050
【摘要】目的：探讨华蟾素联合紫杉醇对人骨肉瘤细胞增殖的抑制作用及机理。方法：体外培养人骨肉瘤U 2OS 细胞，按照实验设计分为对照组、华蟾素组、紫杉醇组、华蟾素联合化疗药组，每组在不同实验条件下按不同时间点（24，48，72h ）进行检测。MTT 法检测各组骨肉瘤细胞生长的抑制率，TUNEL 染观察细胞凋亡程度并计算其凋亡率，免疫荧光染检测凋亡相关蛋白Bax 和Bcl-2的含量并计算其比值，RT-PCR 、Western Blot 法检测凋亡相关及Wnt/β-catenin 通路相关蛋白的表达。结果：MTT 结果显示，华蟾素联合化疗药组细胞生存率明显降低，该组细胞被药物作用48h 后生存率是（24.58±1.65）%，相当于紫杉醇组同期（40.85±1.34）%的1/2（P <0.01）。TUNEL 染显示，与作用于细胞24，48h 相比，作用72h 后凋亡率达到
（60.35±1.57）%，凋亡率明显增加（P <0.01）。免疫荧光、RT-PCR 及Western Blot 法结果提示，随着药物作用时间的延长，华蟾素联合化疗药组Bax 的表达逐渐增加，而Bcl-2的表达逐渐减少，Bax/Bcl-
2含量的比值也逐渐增加。同时，Wnt/β-catenin 通路关键蛋白β-catenin 、caspase-3的表达也逐渐增加。结论：华蟾素具有抑制骨肉瘤U 2OS 细胞增殖和诱导其凋亡的作用，其联合化疗药在疗效上呈时间依赖性，而其机制可能与激活Wnt/β-catenin 通路相关。
【关键词】华蟾素；紫杉醇；骨肉瘤U 2OS 细胞；Wnt/β-catenin 通路中图分类号：R738.1
文献标识码：A
文章编号：1004-2725（2021）6-0481-06
Study on inhibition effect of Cinobufacini combined with Paclitaxel in osteosarcoma U 2OS cells Ma Xiucai 1，Li Jing 2，Ma Xiaoyan 1，Luo Guodong 1，Wang Jianshu 2，Zhan Chunrui 1，Yu Yongzhi 1，Song Jianmin 1.1.Gansu Provincial People's Hospital ，Lanzhou 730000，China ；2.Gansu Provincial Cancer Hospital ，Lanzhou 730050，China Corresponding auther ：Song Jianmin ，E-mail ：********************
【Abstract 】Objective ：To investigate the inhibitory effect of Cinobufacini combined with Paclitaxel on the proliferation of human os －teosarcoma cells and its mechanism.Methods ：Human osteosarcoma U 2OS cells were cultured in vitro and divided into control group ，Cinobu －facini grou
p ，Paclitaxel group and combined group according to the experimental design.Each group was detected at different time points （24，48，72h ）under different experimental conditions.MTT assay was used to detect the growth inhibition rate of osteosarcoma cells in each group.TUNEL staining was used to observe the degree of cell apoptosis and calculate the apoptosis rate.Immunofluore-scence staining was used to detect the content of apoptosis-related proteins Bax and Bcl-2in each group and calculate their ratios.Results ：MTT results showed that the cell survival rate in the combination group was significantly reduced ，and the survival rate in the group was
（24.58±1.65）%48hours after drug treatment ，which was equivalent to 1/2of
（40.85±1.34）%in the chemotherapy group alone （P <0.01）.TUNEL staining showed that the apoptosis rate was （60.35±1.57）%at 72h compared with that at 24and 48h ，and the apoptosis rate was significantly increased （P <0.01）.Im －munofluorescence ，RT-PCR and Western Blot results showed that with the prolongation of drug treatment time ，the expression of Bax increased gradually ，while the expression of Bcl-2decreased gradually ，and the ratio of Bax/Bcl-2content also increased gradually.Meanwhile ，the ex －pression of β-catenin and caspase-3，key proteins of Wnt/β-catenin pathway ，also increased gradually.Conclusions ：Cinobufacini can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of osteosarcoma U 2OS cells.The efficacy of Cinobufacini combined with chemotherape
utic agents is time-dependent ，and the mechanism may be related to the activation of Wnt/β-catenin pathway.
【Key words 】Cinobufacini ；Paclitaxel ；osteosarcoma U 2OS cells ；Wnt/β-catenin pathway
第一作者：马秀才，男，主治医师，从事骨与软组织肿瘤临床诊疗工作通信作者：宋建民，男，主任医师，从事骨与软组织肿瘤临床诊疗工作。E-mail ：********************
骨肉瘤是起源于间叶组织的恶性肿瘤，好发于青少年长管状骨骨骺端，占原发恶性骨肿瘤的1/3，恶性程度高，在局部呈侵袭性生长并且易发生肺转移［1］。骨肉瘤早期手术为主，但仅限于病变较局限的患者。
约20%患者诊断时已肺转移，几乎所有患者死于肺转移［2］。化疗联合手术使患者5年生存率提高到
58%~70%［3］。规范的化疗是控制骨肉瘤进展的有效方法［4］，不仅有助于缩小病变、减轻患者疼痛，而且有助于提高保肢率［5-9］。但长期化疗的毒副作用以及机体对化疗药的耐药，使得寻一种既能协助化疗药物发挥作用，又能减少化疗药物毒副作用的药物尤为重要。
华蟾素由中华大蟾蜍皮的水溶性成分中提取［10］，
·论著·
具有清热解毒、利水消肿、软坚散结等功效［11］。随着对华蟾素作用的进一步研究，发现其具有提高免疫功能、促进肿瘤细胞凋亡和诱导肿瘤细胞分化以及抑制肿瘤细胞增殖等功效［12］。苏劲等［13］将华蟾素作用于膀胱癌细胞株，发现具有一定的抗肿瘤作用，其机制可能与阻滞细胞周期、调节bcl-2、caspase-3基因表达或活性有关。研究发现华蟾素诱导白血病U937细胞凋亡机制可能与华蟾素抑制bcl-2、Fas-1基因及活化Fas基因有关［14］。华蟾素联合化疗或放疗目前被用于部分恶性肿瘤的辅助［15-17］。当华蟾素联合吉非替尼作用于裸鼠肺腺癌移植瘤时，其抗肿瘤效果明显，使移植瘤中bax表达增加，而bcl-xL表达降低［18］。Huang T等［19］通过体外实验研究证实华蟾素联合顺铂能促进骨肉瘤OS-732细胞死亡，其可能机制是上调了Fas表达。
本研究采用华蟾素联合紫杉醇作用于骨肉瘤U2OS 细胞，观察和对比不同组药物在诱导细胞凋亡方面的效果，明确华蟾素联合紫杉醇是否比单独用药在诱导骨肉瘤细胞凋亡中效果更佳，同时也检测了Wnt/β-catenin 通路相关蛋白的表达，再一次探索该机制是否与Wnt/β-catenin通路的活性有关。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1药物。华蟾素注射液由安徽金蟾生化股份有限公司提供（专利号：CN200510005277.4；国药准字Z340 20273，批号：1246219，规格5mL/支），主要成分为蟾毒灵（0.333μg/mL）。紫杉醇由四川升和药业股份有限公司生产（国药准字H20046119，批号1005237，规格：5mL：30mg）。使用前以RPMI-1640培养液稀释至所需浓度。
1.1.2细胞株。人骨肉瘤U2OS细胞购自上海生物制品有限公司研究所。
1.1.3主要试剂及材料。DMEM培养基、EDTA抗原修复液（武汉谷歌生物技术股份有限公司）、MTT、DAPI （4’，6-二脒基-2-苯基吲哚）、TUNEL试剂盒（南通碧云天生物技术研究所）；Trizol试剂（美国Invitrogen Life Technologies公司）；RIPA细胞裂解液（美国Sigma Aldrich公司）；一抗Bax、Bcl-2、caspase-3及辣根过氧化物酶HRP标记的二抗（武汉谷歌生物技术股份有限公司）；RevertAid第一链cDNA合成试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）；2X SYBR绿荧光染料反应混合液（美国Ambion公司）；ECLTM Western Blot 检测试剂盒（英国GE Healthcare公司）。
1.2方法
1.2.1细胞培养及分组。人骨肉瘤U2OS细胞常规培养，取对数生长期细胞用于实验。按照设计分为对照组（Control）、华蟾素组（Cinobufacini）、紫杉醇组（Taxol）、华蟾素联合化疗药组（Cinobufacini+Taxol），对照组采用生理盐水干预，华蟾素组采用1.5μg/mL华蟾素干预，紫杉醇组采
用1.5μg/mL紫杉醇干预，联合组采用1.5μg/mL华蟾素联合1.5μg/mL紫杉醇干预。每组在不同实验条件下按不同时间点（24，48，72h）进行检测。
1.2.2细胞增殖抑制率检测。采用MTT分析法检测细胞增殖抑制率，将细胞以5×105个/mL浓度接种于96孔培养板，设3个复孔，待细胞贴壁后根据实验分组分别加入药物200μL，分别培养24，48，72h后按照MTT 试剂说明书加入相应试剂。每组实验重复3次，以550nm和750nm分别作为检测波长和参照波长，测定各孔光密度值（OD值），每组细胞增殖抑制率（%）=（1-加药孔平均OD值/对照孔平均OD值）×100%。
1.2.3细胞凋亡检测。采用TUNEL染检测，细胞接种于6孔板并孵育24h，加入不同组别药物处理细胞。将处理过的各组细胞再用TUNEL混合液培养2h后用DAPI染10min，PBS清洗3次，TUNEL阳性显（绿染），在荧光显微镜（Nikon Eclipse Ti-SR）下观察并拍照（high power field，HPF，200×）。凋亡率采用平均凋亡细胞数表达。
1.2.4免疫荧光。将细胞接种于铺了片子的24孔板，加入不同组别药物，孵育48h后汇片，取出并置于盛满柠檬酸（pH6.0）/EDTA抗原修复缓冲液（pH8.0/pH9.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。自然冷却后将玻片常规脱及洗涤。切片稍甩干后分别加入一抗（小鼠源性单克隆抗体）及二抗（1∶100HRP标记兔抗小鼠）覆盖细胞，避光室温孵育后滴加DAPI染液，最后用抗荧光淬灭封片剂封片并镜检拍照（日本olympus公司IX51型，200×）。
1.2.5RT-PCR。将各组细胞培养并加入不同组别药物孵育48h。加入Trizol提取总RNA。采用紫外分光度计检测总RNA含量。常规合成cDNA后加入2X SYBR 绿荧光染料反应混合液。以β-actin作为内参，通过观察扩增曲线来测量蛋白mRNA的CT值，具体引物见图1。
1.2.6Western Blot法。①细胞总蛋白及胞浆蛋白样品的收集：将细胞制成单细胞悬液，接种于25cm2细胞培养瓶中，常规培养24h后给予不同组别药物处理48h 并收集细胞，Typan blue染法细胞计数，加入适量的RIPA细胞裂解液及各种蛋白酶抑制剂，震荡制成细胞悬液，高速离心，测定离心液浓度并加入缓冲液煮沸使其变性。②SDS-PAGE电泳：恒压电泳，待蛋白电泳
注：1为对照组；2为华蟾素组；3为紫杉醇组；4为联合组
图5不同药物作用于U 2OS 细胞后其凋亡及Wnt/β-catenin
通路相关蛋白的荧光强度表达
图4不同药物作用于U 2OS 细胞48h 后凋亡率的变化
Control
Cinobufacini
Taxol
Cinobufacini+Taxol
Merge
TUNEL
DAPI
至分离胶下1/3处时，停止电泳。③蛋白印迹分析：凝胶常规移入半干式电转仪。待20V 恒压转膜结束后，
用5%脱脂牛奶封闭转有蛋白的膜1~2h ，再次洗脱后利用适当比例的一抗、二抗孵育，洗脱完毕后，使用Western Blot 检测试剂盒检测蛋白的表达。1.3
数据分析
采用SPSS19.0软件，细胞增殖抑制
率、凋亡率、凋亡及Wnt/β-catenin 通路相关蛋白的表达量以及bax 、bcl-2二者比值均采用均值±标准差
（x ±s ）表示。采用单因素方差分析进行统计处理，P ＜0.05表示有统计学意义。2结果2.1
不同药物对骨肉瘤细胞抑制作用比较
MTT 法
测定结果提示：紫杉醇组抗增殖能力较华蟾素组强，且联合组对细胞的抗增殖能力明显强于单药组。见图2。
2.2不同药物对诱导骨肉瘤细胞凋亡的影响不同
组别药物处理骨肉瘤细胞48h 后进行DAPI 和TUNEL 染，蓝为骨肉瘤细胞，绿光点是发生凋亡细胞，见图3。对照组细胞无明显凋亡，紫杉醇组细胞凋亡率大于华蟾素组，联合组细胞凋亡率明显大于单药组，其
凋亡率如图4所示。2.3
不同药物处理细胞后其凋亡及Wnt/β-catenin 通
路相关蛋白的表达
利用免疫荧光检测法。不同组
别药物作用于细胞后，紫杉醇组bax ，caspase-3表达较华蟾素组有所增加，而Bcl-2表达相对减少，联合组上述蛋白表达变化较单药组趋势显著，见图5。同时，
图1
引物信息图
图2不同药物处理细胞后生存率
图3不同药物作用于U 2OS 细胞48h 后凋亡改变程度
Control
Cinobufacini Taxol
Cinobufacini+Taxol
24h
48h
72h
1251007550250
T h e c e l l v i a b i l i t y o f U 2O S c e l l s （%）
时间
Control Cinobufacini Taxol Cinobufacini+Taxol
80
60
40
20
T h e c e l l a p o p t o t i c （%）
组别
1234
12
34
DAPI
bax
Merge
DAPI
bcl-2
Merge
DAPI caspase-3Merge
DAPI
axin2
Merge
DAPI
GSK-3βMerge
DAPI β-catenin Merge
bax
bcl-2
GSK-3β
axin2
β-catenin
8
6
4
2
m R N A l e v e l （r e l a t i v e ）
Control
Cinobufacini Taxol
Cinobufacini+Taxol
蛋白
图10不同药物作用于骨肉瘤细胞后Bax/Bcl-2比值变化水平
图7不同药物作用于U 2OS 细胞后凋亡及Wnt/β-catenin
通路相关蛋白mRNA 表达水平
图8不同药物作用于U 2OS 细胞后Bax/Bcl-2比值变化水平
注：1为对照组；2为华蟾素组；3为紫杉醇组；4为联合组
图9不同药物对U 2OS 细胞凋亡及Wnt/β-catenin 通路相关
蛋白表达的影响
图6不同药物作用于U 2OS 细胞后其凋亡及Wnt/β-catenin
通路相关蛋白的荧光强度变化趋势
Wnt/β-catenin 通路相关蛋白β-catenin 、axin2表达的增加和GSK-3β表达的减少在联合组细胞中最为明显，见图6。
2.4不同药物处理细胞后凋亡及Wnt/β-catenin 通路相关蛋白的表达（RT-PCR ）相对于单药来说，华蟾素联合紫杉醇作用于骨肉瘤细胞48h 后，细胞中Bax 、β-catenin 表达的增加和Bcl-2、GSK-3β表达的逐渐减少最为明显（图7）。Bax/Bcl-2比值在联合组中变化最大（图8）。
2.5不同药物处理细胞后凋亡及Wnt/β-catenin 通路相关蛋白的表达（Western Blot ）当不同组别药物处理细胞后，促凋亡蛋白bax 表达的增强和抑制凋亡蛋白bcl-2表达的减少在联合组最明显。Wnt/β-catenin 通路关键蛋白β-catenin 的表达在联合组中也最强，如图9。bax 与bcl-2的比值在不同组别中如图10所示。
3讨论
骨肉瘤是最常见的骨原发恶性肿瘤，每年的发病率约为4/100万人，男女之比约为1.5∶1，好发于骨骼生长较快的青少年，超过80％的患者在诊断后5年内死
1
2
3
4
gsk3βBax β-catenin
BCL-2caspase3axin2Actin
Control
Cinobufacini Taxol
Cinobufacini+Taxol
108
6420
荧
光强度变化
bax
bcl-2caspase-3GSK-3βaxin2β-catenin 蛋白
181614121086420
b a x /b
c l -2（%）
Control Cinbufacini Taxol Cinobufacini+Taxol
组别
8
6
4
2
b a x /b
c l -2（%）
Control
Cinobufacini
Taxol
Cinobufacini+Taxol
组别
亡［20］。近年来其发病机制也有倾向于分子生物学及遗传学的研究，主要机制为染体异常、抑癌基因异常、转录因子以及生长因子调控等［21］。抑癌基因的异常突变导致促凋亡蛋白和抑制凋亡蛋白的异常表达，其中P53和Rb基因突变导致了骨肉瘤的发生［22-24］。目前骨肉瘤以新辅助化疗配合手术为主，术后辅助化疗使得患者5年生存率提高到62%~70%［25］。中医药具有毒副作用小、价格低廉等优点，在骨肿瘤方面疗效显著，具有较广阔的开发空间［26］。
华蟾素是我国传统中药蟾皮经加工制成的水溶性注射液，其主要成分为蟾毒灵、华蟾素毒基、脂蟾毒配基［27］。华蟾素已被用于多种恶性肿瘤的辅助，其抗肿瘤作用的机制主要有以下几点：抑制细胞DNA复制、诱导细胞凋亡、提高机体免疫力以及抑制血管内皮细胞生长等［28］。华蟾素的抗肿瘤作用主要通过诱导细胞凋亡实现的［29-30］。朱宁希等［31］使用华蟾素处理白血病细胞株HL-60后发现该药能诱导白血病细胞的凋亡。华蟾素能对胃癌BGC-823细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用，联合5-FU其疗效更显著［32］。孙中杰等［33］通过临床观察总结出术后华蟾素联合阿霉素、丝裂霉素和卡铂的混悬液较单独使用化疗药更能提高患者总有效率和生存率。基于华蟾素一定的抗肿瘤作用，目前将其和化疗药联合使用已成为研究的热点。
随着对华蟾素联合化疗药恶性肿瘤研究的更进一步深入，其联合化疗药物骨肉瘤近期也有报道。华蟾素联合顺铂能通过上调Fas的机制促进骨肉瘤细胞系OS-732的死亡［19］。宋科官等［34］证实华蟾素联合顺铂对骨肉瘤MG-63细胞的杀伤作用明显强于它们的单独应用，且具有时间和浓度依赖性。本实验比较了华蟾素联合紫杉醇对骨肉瘤U2OS细胞的杀伤作用，TUNEL结果显示联合组药物作用于骨肉瘤细胞后，其凋亡形态学变化更加明显。免疫荧光染及RT-PCR结果也表明华蟾素、紫杉醇及二者联合均能使bax、β-catenin表达增加和bcl-2表达减少，联合用药对上调bax和β-catenin表达及下调bcl-2表达能力均强于单独用药。
综上所述，华蟾素具有协同紫杉醇促进骨肉瘤细胞凋亡的作用。本实验也检测了Wnt/β-catenin通路相关
蛋白的表达，结果是联合组细胞中β-catenin的表达较单独用药组增加较明显，β-catenin在Wnt/β-catenin 通路中的作用，如同实验第一部分所述，它在细胞中的表达是反映Wnt/β-catenin通路活性的关键信息。尽管华蟾素在骨肉瘤中的抗肿瘤机制仍不明确，但该实验证实了华蟾素可作为骨肉瘤化疗的辅助用药，能够起
到一定的协同作用。
参考文献
［1］de Azevedo JWV，de Medeiros Fernandes TAA，Fernandes JV Jr，et al.
Biology and pathogenesis of human osteosarcoma［J］.Oncol Lett，2020，
19（2）：1099-1116.
［2］Fan TM，Roberts RD，Lizardo MM.Understanding and modeling metas-tasis biology to improve therapeutic strategies for combating osteosar－coma progression［J］.Front Oncol，2020，10：13.
［3］Jimmy R，Stern C，Lisy K，et al.Effectiveness of mifamurtide in addition to standard chemotherapy for high-grade osteosarcoma：a systematic re－view［J］.JBI Database System Rev Implement Rep，2017，15（8）：
2113-2152.
［4］Benjamin RS.Adjuvant and neoadjuvant chemotherapy for osteosarco－ma：a historical perspective［J］.Adv Exp Med Biol，2020，1257：1-10.［5］Ji WP，He NB.Investigation on the DNA repaired gene polymorphisms and response to chemotherapy and overall survival ofosteosarcoma［J］.
Int J Clin Exp Pathol，2015，8（1）：894-899.
［6］Ferguson JL，Turner SP.Bone cancer：Diagnosis and treatment princi－ples［J］.Am Fam Physician，2018，98（4）：205-213.
［7］Harrison DJ，Geller DS，Gill JD，et a1.Current and future therapeutic approaches for osteosarcoma［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2018，18（1）：39-50.
［8］Su W，Lai Z，Wu F，et al.Clinical efficacy of preoperative chemotherapy with or without ifosfamide in patients with osteosarcoma of the extrem－
ity：meta-analysis of randomized controlled trials［J］.Med Oncol，
2015，32（2）：481.
［9］Yuan W，Yu Q，Wang Z，et a1.Efficacy of diffusion-weighted imaging in neoa-djuvant chemotherapy for osteosarcoma：a systematic review
and Meta-analysi［J］.Acad Radiol，2020，S1076-6332（20）30649-8.［10］张瑜瑶，许长照.蟾酥水溶性总成分的实验研究［J］.南京中医学院学报，1998（2）：32-33.
［11］Qi F，Li A，Zhao L，et a1.Cinobufacini，an aqueous extract from Bufo gargari-zans Cantor，induces apoptosis through a mitochondria-medi－ated pathway in human hepatocellular carcinoma cells［J］.Ethnophar－macol，2010，128（3）：654-661.
［12］Wang J，Cai H，Liu Q，et a1.Cinobufacini Inhibits Colon Cancer Inva－sion and Metastasis via Suppressing Wnt/β-Catenin Signaling Pathway
and EMT［J］.Am J Chin Med，2020，48（3）：703-718.
［13］苏劲，许志坚，叶木石.华蟾素诱导膀胱癌细胞凋亡的实验研究［J］.
细胞与分子免疫学杂志，2009，25（4）：351-353.
［14］张莉，李军民，钱樱，等.华蟾素诱导U937细胞凋亡及其作用机制［J］.
肿瘤，2007，27（5）：341-344.os是什么意思肿瘤
［15］Li Q，Liang RL，Yu QR，et al.Efficacy and safety of cinobufacini injec－tion combined with vinorelbine and cisplatin regimen chemotherapy for
stageⅢ/Ⅳnon-small cell lung cancer：A protocol for systematic re－view and meta-analysis of randomized controlled trials［J］.Medicine （Baltimore），2020，99（31）：e21539.
［16］Chen T，Li D，Fu YL，et al.Screening of QHF formula for effective ingre－dients from Chinese herbs and its anti-hepatic cell cancer effect in－
combination with chemotherapy［J］.Chin Med J（Engl），2008，121（4）：
363-368.
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