川南地区汉族人D1S80基因座多态性分析
作者：张天丹等
来源：《中国医药科学》2014年第01期
        [摘要] 目的 了解川南地区汉族人D1S80位点体遗传多态性。方法 采用PCR结合聚丙烯酰胺PAGE电泳及高灵敏度银染技术，即Amp-FLP方法对川南地区120名汉族无血缘关系个体D1S80位点进行多态性分析。结果 在所调查的120名无关个体样本中，观察到D1S80基因座有18个等位基因，基因频率分布在0.004166667～0.1958333333之间，杂合度为0.7869，个体识别力为0.87，非父排除率为0.8152，其基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡法则。结论 D1S80基因座的PCR分型具有较好的准确性和灵敏度，为法医学个体识别和亲权鉴定、遗传病基因链锁分析等的研究及应用提供了川南地区有用的遗传信息。
        [关键词] D1S80位点；VNTR；遗传多态性；川南地区
        [中图分类号] Q786 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）01-09-03
        人类基因组中存在许多具有高度多态性的可变数目串联重复序列（variable number tande
m repeat，VNTR）。D1S80是以16bp为重复单元的VNTR位点，是进行法医学个体识别和亲权鉴定、遗传病基因链锁分析等研究的良好遗传标记之一[1-3]。D1S80位点的遗传信息虽然在我国汉族其他地区已有报道[3-5]，但是川南地区汉族人D1S80位点体遗传资料并不清楚。现应用扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，Amp-Flp），即PCR结合高分辨PAGE电泳及高灵敏度银染技术[1]，首次对四川南部地区120名汉族无血缘关系个体D1S80
        1 材料与方法
        1.1 样本收集与DNA提取
        收集川南泸州地区汉族无关个体外周血样本120名样本，均于2012年6月～2013年3月在泸州医学院附属医院检验科收集，EDTA抗凝，用蛋白酶消化和酚/氯仿法提取DNA[6-7]。紫外分光光度计测定OD260和OD280值，并确定样本浓度及纯度[7-8]。
        1.2 主要仪器及试剂
        基因扩增仪（德国EPP224-Eppendorf 5331型），电泳系统（美国BIO-RAD Powerpac
Basic），凝胶图像成像仪（美国BIO-RAD），蛋白酶K，2×Taq master mix，dNTP，丙烯酰胺。扩增D1S80位点的引物序列为（DS80R： 5’-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3’，D1S80L： 5’-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3’）。
        1.3 PCR扩增
        用20μL体系，含DNA样本3.5μL基因多态性约10ng，2μL引物，10μL的2×Taq master mix，4.5μL的ddH2O。扩增条件为：先95℃预变性1min 30s，再94℃变性40s，65℃退火30s，72℃延伸40s，共完成35个循环，然后72℃延伸5min，最后置4℃保温。
        1.4 扩增产物的电泳检测
        先用1.5%的琼脂糖凝胶水平电泳PCR扩增产物，根据条带亮度决定下一步的垂直聚丙烯酰胺电泳中所加入的样本量。然后，用凝胶板大小160mm×200mm×0.75mm，凝胶浓度5%，作垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳缓冲液1×TAE，150V恒压电泳70～90min，银染显带。银染结果在凝胶图像成像仪（BIO-RAD）上分析并照相。并将D1S80位点等位基因扩增产物进行直接测序，建立分型标准。
        1.5 统计学处理
        基因频率按照直接计数法测定，用x2检验比较基因型分布资料的观察值及理论值，判断是否符合Hardy-Weinberg平衡，杂合度（H），个体识别力（DP）的计算参照《法医物证学》[9]，非父排除率（PE）的计算参照文献[10]的方法计算。
        2 结果
        我们收集川南泸州地区汉族无关个体外周血样本120名，用蛋白酶消化和酚/氯仿法提取DNA，用紫外分光光度计测定OD260和OD280值，发现样本DNA浓度及纯度好。然后对这些无血缘关系个体完成了D1S80基因座多态性PCR和PAGE电泳分析。代表性电泳结果如下图1所示（图1）。
        M：DNA分子量标记DL600（显示400和500bp片段）；
        下标26/31为一无关个体的两个等位基因的分型大小，其他个体的等位基因分型亦在下标中注明
        在所调查的120名泸州地区汉族无亲缘关系个体样本中，共观测到D1S80基因座有18个等位基因，基因频率分布在0.004166667～0.1958333333之间（表1），其频率以D1S80*23（0.195833333）最高。杂合度为0.7869，个体识别力为0.87，非父排除率PE为0.8152。
        3 讨论
        随着遗传学研究的不断深入和人类基因组计划的完成，人们发现人类基因组中存在大量具有高度多态性的可变数目串联重复序列[1-3]。其中D1S80是以16bp为重复单元的VNTR位点，定位于染体1p，其核心序列为GNNGACCACCGGNAAG。对这些可变数目串联重复序列和短串联重复序列（short tandem repeat，STR）多态性分析是非常必要的。从我们对川南地区120名汉族无血缘关系个体D1S80基因座多态性进行的研究表明，该位点的PCR分型具有较好的准确性和灵敏度（图1）。在所调查的120名泸州地区汉族无亲缘关系个体样本中，共观测到D1S80基因座有18个等位基因，基因频率分布在0.004166667～0.1958333333之间，其频率以D1S80*23（0.195833333）最高。杂合度为0.7869，个体识别力为0.87，非父排除率PE为0.8152。
        虽然国内有不同的学者在多个不同地区汉族、或者不同民族的无血缘关系人中，进行
了D1S80位点的多态性遗传学分析[2，4-5，11-15]，但我们是首次对川南地区汉族人的分析。在这里，我们调查了川南地区汉族人120名汉族无血缘关系个体，对D1S80基因座的分析结果表明，该基因座多态信息含量大，杂合度、个人识别力高，排除非父的几率高，有利于从实践上提高本地区相关鉴定的准确性和有效性。从而为法医学个体识别和亲权鉴定、遗传病基因连锁分析等的研究及应用提供了对川南地区非常有用的遗传信息，丰富了D1S80多态性信息，是对我国汉族人D1S80遗传信息的非常重要的补充。
        [参考文献]
        [1] Budowle B，Chakraborty R，Giusti AM，et al.Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE[J].Am J Hum Genet，1991，48（1）：137-144.
        [2] Yajun Deng，Bofeng Zhu，Chunmei Shen.Genetic polymorphism analysis of 15 STR loci in Chinese Hui ethnic group residing in Qinghai province of China[J].Mol Biol Rep，2011，38（4）：2315-2322.
        [3] Köseler A，Öztürk O，Atalay A.Allele frequency of VNTR locus D1S80 observed in Hb D-Los Angeles carriers[J].Mol Biol Rep，2012，39（12）：10747-10750.
        [4] 冯哲，张雁征，杨颖，等.用Amp-FLP方法分析在江浙沪汉族人DIS80位点多态性[J].遗传，1996，18（4）：5-18.
        [5] 谢小东，王勋陵，孙红兵，等.甘肃汉族人D1S80基因座多态性分析[J].中国法医学杂志，2000，15（2）：93-94.
        [6] JJ Fu，LY Li，GX Lu.Relationship between microdeletion on Y chromosome and patients with idiopathic azoospermia and severe oligozoospermia in the Chinese[J].Chin Med J，2002，115（1）：72-75.
        [7] 傅俊江.精编医学分子生物学实验指导[M].北京：中国医药科技出版社，2012：61-63.
        [8] Junjiang Fu，Luquan Yang，Md.Asaduzzaman Khan，et al.Genetic characterization and authentication of Lonicera japonica Thunb.by using improved RAPD a
nalysis[J].Mol Biol Rep，2013，40（10）：5993-5999.
        [9] 侯一平.法医物证学[M].第3版.北京：人民卫生出版社，2009：11-23.
        [10] 贾静涛.DNA分析中的统计方法[J].中国法医学杂志，1995，10（3）：188-191.
        [11] 杨电一，刘超，彭汝标，等.南方汉族、黎族人15个STR基因座频率调查[J].中国法医学杂志，2002，18（4）：207-212.
        [12] 汪萍，朱少建，刘超，等.广西地区3个少数民族15个STR基因座的遗传多态性[J].中国法医学杂志，2003，18（5）：299-300.

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。