CTLA-4基因启动子及外显子区域多
态性与胃癌的相关性研究基因多态性
亓玉琴崔伟丽司君利徐保华
【摘要】目的：本文旨在探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）基因外显子49位点、启动子1661位点及1722位点单核苷酸多态性（SNP）与青岛地区人胃癌的发病率有无关系。方法：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态分析检测来自青岛地区人胃癌患者、萎缩性胃炎及对照组患者中CTLA-4+49A/G、-1661A/G及-1722T/C基因多态性的分布。结果:①胃癌组外显子49位AG及GG基因型频率显著高于对照组（P均<0.05），携带AG及GG基因型者罹患胃癌的风险分别增加至2.63倍及5.69倍。②启动子1661位AG+GG基因型频率显著高于对照组（P=0.01），携带AG+GG基因型的个体罹患胃癌的风险增加到2.63倍。③与对照组相比，胃癌组及萎缩性胃炎组1722位点各基因型分布差异无统计学意义。结论：CTAL-4+49A/G及-1661A/G基因多态性与胃癌的遗传易感性相关。
关键词：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4；多态性，单核苷酸；胃肿瘤；
Polymorphism of CTLA-4 and Helicobacter pylori infection on gastric cancer genesis  QI Yu-qin, SI Jun-li，CUI Jing-yuan，et al. Department of Gastroenterology，Qingdao municipal hospital，Qingdao Shandong 266011，China
Correspondingauthor:SIJun-li,Email:*****************
【Abstract】Objective To analyze the relationship between extron 49 site and promoter 1661 and 1722 in CTLA-4 gene polymorphism and infection of Helicobacter in Qingdao area and susceptibility to gastric cancer genesis．Methods  Polymerase chain restriction fragment length polymorphism and direct sequencing were performed to analyze the genotype of the A/G polymorphism in 49 site ，1661 site and 1722 site 。Results ①The frequency of AG and GG genotype in 49 site were higher in the gastric cancer group compared to the control group (P <0.05)。②The frequency of AG+GG genotype in 1661 site was higher in the gastric cancer group compared to the control group(P=0.01)，moreover，individuals with the CTLA-4-1661AG+GG genotype rose to 2.63 fold risk for gastric cancer．③The frequency of all genotype at point 1722 was not significantly different between gastric cancer group and control group。Conclusion There was a relationship between CTLA-4+49 A/G and 1661 A/G polymorphism and susceptibility to gastric cancer．
【Key words】Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4；Polymorphism，single nucleotide；Stomach neoplasms；Helicobacter pylori
胃癌的发生是多种因素共同作用的结果，幽门螺杆菌(Hp)感染和宿主的遗传背景同时发挥着至关重要的
作用，具体发病机制尚不明确。T细胞的活化是机体抗肿瘤免疫的重要机制，其失活有赖于细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）与B7的结合，从而降低机体的肿瘤免疫能力。研究发现，CTLA-4基因多态性可影响其表达及功能，CTLA-4 外显子1 中G等位基因频率增高，CTLA-4 抑制T细胞的活化功能就降低[1]。本研究旨在分析CTLA-4外显子49A/G、启动子1661A/G及1722C/T 在青岛地区胃癌及萎缩性胃炎人中的分布，并探讨CTLA-4基因多态性与胃癌发生发展的相关性，为胃癌的早期诊断及预防提供分子水平的理论依据。
资料与方法
一、一般资料
本试验选取2011年3月-9月青岛市市立医院消化科及普外科住院和门诊的118例胃癌，萎缩性胃炎60例和对照组96例。所有患者均经组织病理学确诊，术前未经放疗和化疗，对照组取自无肿瘤病史和体征的健康体检的青岛地区汉族人。采集每位研究对象空腹静脉血2ml。
二、方法
1.外周血DNA提取：选用百泰克生物公司提供的DNA提取试剂盒提取外周血白细胞DNA，储存于-20℃冰箱中备用。
2.聚合酶链（PCR）反应：PCR引物序列由上海生工生物有限公司合成，引物序列为49A/G：上游5’-AATTGGGATTTAGGAGGACC-3’下游为5’-AATACAGAGCCAGCCAAGCC- 3’，1661A/G 及1722T/C：上游为5’-CTAAGAGCATCCGCTTGCACCT -3’，下游引物为5’-TTGGTGTGATGCACAGAAGCCTTTT -3’。扩增反应总体系为10μl。反应条件为：95℃预变性5 min，然后进行35个循环：94℃变性30s，分别以60℃、58℃及60℃退火30s，72℃延伸45s，最后72℃延伸10 min，扩增的DNA片段长度为分别为641bp和486bp。
聚合酶链反应一限制性片段长度多态法（PCR-RFLP）检测CTLA-4+49A/G、-1722及-1661A/G 位点多态性：前两者采用限制性内切酶BbvI，-1661位采用内切酶MseI对扩增产物进行酶切，水浴16-24h，取酶切产物4μl 上样于2%琼脂糖120V， 25min电泳分离，观察DNA条带。
3.DNA序列分析：随机挑选3种不同的PCR—RFLP分型结果的标本，将PCR产物送上海生工公司进行直接测序予以确认。
三、统计学分析
采用SPSS17.0统计软件，采用χ2检验行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，各组之间的基因型差异以χ2检验进行比较，基因多态性与胃癌发生的风险性以OR值（odds radio）和95%置信区间（CI）表示，P﹤0.05差异有统计学意义。
结果
一、遗传平衡检验
经χ2检验，所选各组样本均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，具有代表性。二、各组CTLA-4外显子49A/G、启动子1661A/G及1722位基因型分布（见表1），各组基因型电泳图谱见下图
1  2  3    4  5  6  7
图1  CTLA-4外显子49位点PCR-RFLP酶切电泳图
注：1,3：AA基因型(641bp)，2,7：AG基因型(641bp+221bp+420bp)，4,6：GG基因型(221bp+420bp)，5：Marker 1
1    2    3  4  5  6    7
图2  CTLA-4启动子1661位点PCR-RFLP酶切电泳图
注：1：Marker 1，2,3,7：AA基因型(333bp+153bp)，4,6：GG基因型(486bp)，5：AG基因型(486bp+333bp+153bp)
1  2  3  4  5 6 7  8  9
注：1：Marker1，2,3,4:CT基因型（486bp+257bp+229bp），5,6：CC基因型（257bp+229bp），7,8,9：TT基因型（486bp）
图3 CTLA-4启动子1722位点PCR-RFLP酶切电泳图
1、+49A/G多态位点基因型分布：萎缩性胃炎组及胃癌组AG基因型的分布频率都显著高于对照组（P=0.04，P=0.035），且携带AG基因型罹患胃癌的风险增加到2.63倍（95%CI：1.053-6.542）。GG基因型在萎缩性胃炎组及胃癌组的分布频率也显著高于对照组（P=0.006，P=0.00），且携带GG 基因型的个体较携带AA基因型的罹患胃癌的风险增加到5.69倍（95%CI：2.262-14.302）。
2、-1661A/G多态位点基因型分布：由于AG及GG基因型频率在人中的分布较少，故我们将两者一同分析。与对照组相比，萎缩性胃炎组及胃癌组AG+GG基因型频率的分布频率都有显著差异（P=0.027，P=0.01），结果显示：携带AG+GG基因型者罹患萎缩性胃炎风险较携带AA者增到
2.58倍（95%CI ：1.092-6.074），罹患胃癌的风险增加到2.63倍（95%CI： 1.241-5.590）。
3、-1722T/C多态位点基因型分布：与对照组相比，萎缩性胃炎组及胃癌组各基因型携带频率的差异无统计学意义。见表1
表1 CTLA-4基因多态性与胃癌易感性的关系
对照组萎缩性
胃炎组
胃癌组χ2P值OR(95%)
CTLA-4+49
AA 21(21.9)
4(6.6) 8(6.8)
4.323a 0.04a  3.267(1.105-10.511)a
AG 45(46.9)
28(46.7)45(38.1)
4.461b 0.035b  2.625(1.053-6.542)b
7.682a 0.006a  4.9(1.495-16.056)a
GG 30(31.2)
28(46.7)65（55.1）
15.301b0.00b  5.688(2.262-14.302)b
CTLA-4-1661
AA 85(88.5)
45(75)
88(74.6)
4.875a 0.027a  2.576(1.092-6.074)a
AG+GG 11(11.5) 15(25) 30(25.4)
6.666b 0.01b  2.634(1.241-5.590)b
CTLA-4-1722
TT 37(38.5)
20(33.3)40(33.9)
0.448a 0.503a  1.274(0.626-2.594)a
TC 45(46.9)
31(51.7)69(58.5)
1.380b 0.240b  1.418(0.791-
2.543)b
0.116a 0.734a  1.189(0.438-3.228)a
CC 14(14.6)
9(15.0)
9(7.6)
1.164b 0.281b0.595(0.230-1.5360b
注：a萎缩性胃炎组比对照组b胃癌组比对照组
讨论
CTLA-4主要表达在CD4+CD5+T细胞的表面，在CD28与B7结合以后CTLA-4被激活，也与B7结合，参与下调T细胞的反应[2]，故CTLA-4是T细胞表面重要的负性调节因子，与B7结合可以抑制T细胞的活化[3]，从而降低机体抵抗肿瘤的免疫能力。
CTLA-4基因位于人类染体2q33，含有1个内含子及4个外显子，人们已经发现CTLA-4基因具有多个多态性位点，位于启动子的-1661A/G,-318C/T[4]、-1722T/C及+1822C/T等碱基的置换，外显子3中的第642位（AT）n 重复序列[5]，至少有23 个不同的等位基因，碱基AT 重复7～30 次。还发现159 位点C/G碱基的互换，此基因变异导致编码的53 号氨基酸出现的异亮氨酸与蛋氨酸的互换[6]。
研究发现，CTLA-4基因多态性具有重要的生物学意义，尤其是启动子区及外显子区域的基因多态性[7]，当CTLA-4 启动子318 位点为胸腺嘧啶，外显1第49位点为腺嘌呤时，细胞表达的CTLA-4 水平增高[8]，从而影响机体抵抗肿瘤的能力，已有不少研究发现，CTLA-4基因多态性与非霍奇金淋巴瘤、肾癌、胃癌及结肠癌的相关性，但是由于地域及人种的差异，在我国关于其与胃癌的相关性
少见报道。
本实验发现，萎缩性胃炎组及胃癌组中CTLA-4外显子49位AG及GG的分布较对照组相比都有显著差异，从而证明携带AG及GG基因型的人罹患胃癌癌前病变及胃癌的风险比携带AA基因型者高，进一步分析发现A等位基因为保护性基因。由于启动子1661位AG及GG的分布在各组都较少，我们将两者一同分析，结果发现携带AG+GG基因型者罹患萎缩性胃炎及胃癌的风险比携带AA基因型人分别增加到2.58倍（95%CI：1.092-6.074），2.63倍（95%CI ：1.241-5.590），进一步证明A等位基因为保护性基因，这与Erfani N等[9]研究发现CTLA-4-1661位多态性与乳腺癌的易感性相关的结论是一致的。Hadin
ia A等[10]证实CTLA-4在启动子及外显子多个位点多态性与伊朗人胃癌及结肠癌的发病率无相关性，本实验亦发现胃癌组及萎缩性胃炎组在1722位点上个基因型的携带频率与对照组相比差异无统计学意义（P均>0.05）。
胃癌的发生发展是多种基因共同作用的结果，也是某一个基因多个多态性位点相互作用的结果，本研究发现CTLA-4基因启动子及外显子区域49及1661位点基因多态性与胃癌的发生相关，但是两者之间是否有协同作用更有待于进一步研究。
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