doi : 10.3969/j .issn.2095-3887.2020.02.003
FecB 基因在5个中国地方绵羊品种中的多态性及其
与产羔数的关联分析
喇永富$，李发弟巴杨 勤2，石红梅2，李俊龙"，王 钢&，张小雪王维民'
(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州730070;2.甘南藏族自治州畜牧工作站，
甘肃 合作747000；3.甘肃省肉羊繁育生物技术工程实验室，民勤733000；
4.内蒙古赛诺草原羊业有限公司，呼和浩特010000)
摘要：为解析中国地方绵羊品种产羔数差异形成的遗传学机制，以5个不同繁殖力的中国地方绵羊品
种(湖羊、藏羊、蒙古羊、阿勒泰羊和多浪羊)为研究对象，利用PCR-RFLP 技术检测FecB 基因的多态
性，比较不同繁殖力体间FecB 的 ，并与其产羔数进行关联分析。结果显示：湖羊体中存
在BB 、B+、++三种基因型，藏羊、蒙古羊及阿勒泰羊体中仅存在B+和++两种基因型，多浪羊
体中仅存在卄基因型。湖羊、藏羊、蒙古羊、阿勒泰羊及多浪羊体中BB 、B+及++基因型频率依次 是 0.69、0.28、0.03,0.00、0.13、0.88,0.00、0.08、0.92,0.00、0.08、0.92 和 0.00、0.00、1.00;B 等位基因频率
由高到低依次为 羊 > 藏羊 > 蒙古羊=阿勒泰羊〉多浪羊。湖羊、藏羊、蒙古羊和 羊中
点 He 和'(C 分别为 0.29、0.25,0.12、0.11,0.08、0.07 和 0.08、0.07，且在以上 4 个品种中 BB 和 B+ 基
因型个体产羔数比卄基因型个体高('<0.01),BB 基因型个体和B+基因型个体之间无差异('>0.05)。
由此可推断,FecB 或许是决定绵羊产羔数的主效基因，亦或是与其存在密切相关的标记基因，可助力
绵羊产羔数性状MAS 技术和为多胎绵羊新品种(系)培育提供素材。关键词:FecB ；湖羊；蒙古羊；藏羊；阿勒泰羊；多浪羊
中图分类号：S826.2 文献标志码：A 文章编号：2095-3887(2020)02-0012-06
Genetic Polymorphism of F ecB Gene and Effect in Five Chinese Local Sheep Breeds
La Yongfu 1, Li Fadi 1,3, Yang Qin 2,Shi Hongmei 2, Li Junlong 4, Wang Gang 4, Zhang Xiaoxue 1,3, Wang Weimin 1
(1 .College of Animal Science and Technology , Gansu Agricultural University , Lanzhou 730070, China ;
2.Gannan Institute of Animal Science and Study , Gannan , Gansu 747000, China ;
sheep , Altai sheep and Duolang sheep were 0.69,0.28,0.03 ;
0.00,0.13,0.88;0.00,0.08,0.92;0.00,0.08,0.92 and 0.00,0.00,1.00 respectively.B allele frequency from high to low in the order was Hu sheep>Tibetan>Mongolian=Altai>Duolang . In addition , the
3.Sheep Breeding Biotechnology Engineering Laboratory of Gansu Province , Minqin , Gansu 733300, China ;
4. Inner Mongolia Sainuo Grassland Sheep Industry CO., LTD , Huhehaote , Inner 010000, China )
Abstract : This study compared the polymorphism of FecB gene in the Hu sheep , Tibetan sheep , Mongolian sheep , Duolang sheep and Altai sheep , and analyzed the relation between different fecundity and genotype , which would provide a theoretical
basis for marker-assisted selection and breeding for prolificacy in sheep. The gene polymorphism of FecB gene was analyzed by PCR-RFLP to compare the differences between the groups of different fertility.The results showed that there were three genotypes ( BB , Bd and ++)in Hu sheep , while two genotypes ( Be and ++)were found in Tibetan sheep , Mongolian sheep and Altai sheep , and only ++ genotype existed in Duolang sheep. The genotype frequency of BB , B+ and ++ in Hu sheep , Mongolian
收稿日期：2019-10-16
基金项目：甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目(GNSW-2016-10)；国家畜
禽良种联合攻关计M19190520)；甘肃省高等学校创新能力提升项目(2019B-080) 作者简介：喇永富(1988-)，男，博士研究生，研究方向为动物遗传育种
通信作者：王维民(1984-)，副教授，博士，硕士生导师，主要从事绵羊功能基因组 与分子育种研究
He and PIC for Hu sheep,Tibetan sheep,Mongolian sheep and Altai sheep were0.29,0.25;0.12,0.11;0.08,0.07and 0.08,0.07.And in the above four varieties of BB and B+individual lambing number was significantly higher than++genotype (&J0.01),CC and B+no difference between individuals,FecB gene might be a major gene which affected the prolificacy trait of sheep or it was regarded as a genetic makers closely linked to target gene and could be as a marker assisting selection and breeding of improve fecundity.
Keywords:FecB;Hu sheep;Mongolian sheep;Tibetan sheep;Altai sheep;Duolang sheep
产羔数是绵羊重要的经济性状之一，受微效多基因的控制，在生产实践中很难用传统的育种方法来提高绵羊体的产羔数[1]o目前，国内外提高绵羊繁殖性能常用的方法是利用基因工程技术进行分子育种，从基因水平上提高绵羊的繁殖性能，然而到与绵羊繁殖性能相关的分子标记是以上繁殖性状分子标记辅助选择的基础!%&3"。
对于绵羊繁殖性状相关基因的研究最早且作用机制最清楚的是FecB基因I。FecB基因是1980年Davis 等在Booroola绵羊的常染体上发现的可以增加Booroola绵羊产羔数的基因!3#6"。经研究，FecB表型的出现是由于绵羊BMPRIB基因编码区第746位碱基A突变为G引起的，该突变导致BMPRIB 基因编码的第249位氨基酸由谷氨酰胺转变为精氨酸，使得BMPRIB基因编码的受体内分失活!8&9"，从而削弱了BMPRIB基因对颗粒细胞类固醇合的制作用，突的羊分，进而突的羊，
数增加!19&12"。不同的学者在Booroola羊!3#7#10"、Garole羊!13"、Javanese羊!13"、小尾寒羊!14&16"、湖羊!17&18"、中国美利奴羊、滩羊、陶赛特羊、Lacaune羊、Woodlands羊、Olkuska羊、Belclare羊、Cambridge羊等多个绵羊品种中检测到FecB突变[14'16'19]O在Booroola羊、Garole羊‘Javanese羊、小尾寒羊和湖羊中检测到FecB突变，并对上述5个绵羊品种的多胎性、排卵数，在中国美利奴羊羊羊Lacaune羊Woodlands羊Olkuska 羊、Belclare羊、Cambridge羊中没有发现FecB突变。以上研究结果表明，在的绵羊品种中FecB基因的功能不同。因此，检测我国不同绵羊品种中FecB基因的分，分绵羊体中基因与产羔数之的关对国绵羊育种关重要。
本实验利用PCR-RFLP技术在湖羊、阿勒泰羊、蒙古羊、多浪羊和藏羊5种不同繁殖力的中国地方绵羊品种中检测BMPR-IB基因的A746G位点(FecB)是否生突，从而羊羊羊多羊羊5种是FecB基因对繁殖性状的作用，以期国内方绵羊种的高繁殖力遗传机理，推动我国高繁殖力绵羊新品系的培育进程。
!材料与方法
1.1实验动物
实验动物的品种、采样地点、产羔数等信息详见表1。
1.2基因组DNA的提取
参照Chen等如方法，运用酚-氯仿抽提法提取基因组DNA,-20!贮存待用。
表1不同繁殖力绵羊全血采集情况
品种采样地点
羊全血样采集数量
产羔数=1产羔数!2藏羊甘南藏族自治州玛曲县欧拉乡安茂五队
青海省海北藏族自治州祁连县峨堡镇
4931
蒙古羊内蒙古赛诺草原羊业有限公司的科技园区、特配场
内蒙古自治区四子王旗白音朝克图镇
2861
羊甘肃省金昌中天羊业有限公司
甘肃三洋金源农牧股份有限公司
2533羊新疆阿勒泰地区福海县阿尔达乡阿克吉拉村2624
多浪羊新疆喀什地区麦盖提县昂格特勒克乡2932计157181
1.3绵羊BMPR-IB基因（FecB&引物的设计与扩增
参考储明星等炉"公布的《绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程》，设计扩增FecB基因A746G突变位点的引物：上游引物序列为,-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3!；下游引物序列为,-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3z，委托北京六合华大基因科技有限公司合成。
PCR反应总体积为25“L，其中DNA模板1m L,2x PCR Master Mix12.5“L，上游引物0.8m L（10“M），下游引物0.8”L（10!M）,dd@2。10皿PCR反应程序：94#预变性5min；94#变性30s,58#退火30s,72#延伸30s，共34个循环；最后72#延伸10min,4#保存。PCR扩增结束后，琼脂糖凝胶（1.5%，含0.5“L/mL Goldview）电泳检测。
1.4PCR产物的酶切
扩增检测合的PCR物，反应总体积10!L：其中PCR产物5!L,Ava"限制性内切酶0.5^L,1x buffer1“L用灭菌
水补足10“L，将样品混合后，之后在37#2h。通过琼脂糖凝胶电泳（2%）法检测酶切结果，紫外灯下拍照并进行基因型分型。
1.5统计分析
用POPGENE软件（Version3.2）计算基因频率、基因型频率，多样性参合（Gene heterozygosity,@e）、纯合度（Gene homozygosity,@o）、有效等位基因数（Effective allele numbers,Ne）和多态信息含量（Polymorphic information content,PIC）。采用SPSS 19.0软件中的卡方独立性检验进行Hardy-Weinberg平衡状态检验。
FecB基因的SNP与多胎性状的相关分析采用如下模：
—ijki=!3Genotyp e汁B reed汁P k+S i+Comb inationm-^s^
其中，-阳，“是总体的平均数‘Genotype.是基因型效应‘Breed.效应,P»是胎次效应,S，是场次效应,Combinationm是组合效应，"醐是随机误差，假定，服从@（0,#2）分布。
2结果与分析
2.1PCR扩增结果
1，扩增物的大
相符（140bp），加之扩增明，性强，
行下一步的酶切分析。
1234567M
140bp
2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp 注：M泳道为DNA分子量标记（DL2000）
图1FecB基因的PCR扩增图
2.2PCR扩增产物的A+a#酶切
将PCR产物与A+a#内切酶（GvGWCC）进行混 合，并在37#恒温箱中消化2h，之后用2%的琼脂糖凝检测。2可见，该位点在湖羊（2A）体中存在3种基因型，分别是110bp和30bp的酶切条带（BB）,140、110和30bp的酶切条带（B+）及140bp 的（++）；在藏羊（图2B）、阿勒泰（2C）和蒙古羊（图2D）羊中只检测到B+和++两种基因型；而多浪羊（图2E）体中只发现++—种基因型。上述结果表明，羊羊、蒙古羊阿勒泰羊基因位点存在多态性，而多浪羊基因位点不存多态性。
BB BB B+B+++ ++M
2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp A 140bp
110bp
B+B+B+++ ++ ++M
2000bp
1000bp
750bp
500bp
250bp
100bp
B
B+ B+ B+ ++ ++ ++ M
B+ B+ B+ ++ ++ ++ M ++ ++++ ++ M
++140 bp
++250 bp
100 bp
E
2000 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 注：M 泳道为DNA 分子量标记(DL2000)
图2湖羊(A)、藏羊(B )、阿勒泰羊(C )、蒙古羊(D )和多浪羊(E )FecB 基因
PCR-RFLP 不同基因型凝胶电泳图
2.3 FecB 基因在不同品种中的遗传多态性
由表2可知，湖羊、藏羊、蒙古羊、阿勒泰羊和多浪
羊BB 、B +及++基因型频率依次是0.69、0.28、 0.03,0.00、0.13、0.88,0.00、0.08、0.92,0.00、0.08、0.92 和
0.00、0.00、1.00；B 和+等位基因频率分别为0.83、
0.17,0.06、0.94,0.04、0.96,0.04、0.96 和 0.00、1.00；B 等
位基因频率由高到低依次为：湖羊>藏羊>蒙古羊=
阿勒泰羊 > 多浪羊。
进一步分析发现，在湖羊、藏羊、蒙古羊及阿勒泰
羊中该位点He 以及PIC 依次为0.29、0.25,0.12、
0.11,0.08^0.07和0.08、0.07，其中湖羊表现为中度多
态，可见在湖羊中FecB 的多态性较高，遗传 较，
可 性 分析的 基因，可在高
湖羊繁殖力的MAC 技术上广泛使用。
表2 5个绵羊品种FecB 基因位点的体遗传结构
品种
个体数
基因型频率等位基因频率
0HWE )PIC He H-Ne
BB
B+++B +
藏羊800.000.13
0.88
0.060.940.360.110.120.88 1.13蒙古羊
890.000.080.920.040.960.150.070.080.92 1.08阿勒泰羊50
0.000.080.92
0.040.96
0.090.07
0.08
0.92 1.08多浪羊
610.00
0.00
1.000.00
1.00-
0.000.00 1.00 1.00湖羊58
0.690.280.03
0.830.17
0.06
0.25
0.29
0.71基因多态性
1.40
注:PIC > 0.5为高度多态,0.25 < PIC 7 0.5为中度多态,PIC 7 0.25为低度多态
2.4 FecB 基因在高、低繁殖力羊中的分布
根据母羊产羔数在湖羊、藏羊、蒙古羊、阿勒泰羊4
个品种内将羊分为高、低繁殖力组，分别分析不同品
种及繁殖力羊中FecB 基因在该位点的基因型频率、
等位基因频率，计算结果如表3。在高、低繁殖力湖羊、 藏羊、蒙古羊及阿勒泰羊的B 等位基因频率依次为
0.89、0.74,0.16、0.00,0.06、0.00 和 0.06、0.02,B 等位基
因频率在高繁殖力湖羊、藏羊、蒙古羊及阿勒泰羊中比
低繁殖力羊中要高
。
品种繁殖性能个体数
基因型频率
BB B+++等位基因频率B+
表3不同繁殖力绵羊FecB基因多态性
藏羊高310.000.330.680.160.84低4(0.000.00 1.000.00 1.00蒙古羊高610.000.120.890.060.94低280.000.00 1.000.00 1.00阿勒泰羊高240.000.130.880.060.94低260.000.040.960.020.98湖羊高330.790.2100.890.11低250.560.360.080.740.26
2.5FecB基因多态性与产羔数的相关分析
利用广义线性模型(Generalized linear model,GLM)对FecB基因不同基因型与湖羊、藏羊、蒙古羊和阿勒泰羊产羔数进行相关分析。由表4可知，在以上4个绵羊品种中BB型和B+型个体的产羔数均极显著高于++型个体(&<0.01)，而BB型个体和B+型个体之间无显著性差异(&>0.05)。以上研究结果表明，FecB基因与湖羊、藏羊、蒙古羊和阿勒泰羊产羔数显著相关。
表4FecB基因不同基因型与产羔数的相关性
基因基因型个体数均产羔数/只
BB40 2.70±0.66Aa FecB B+37 2.83±0.38Aa
++200 1.21±0.42BE 注：同列数据肩标相同小写字母表示差异不显著(&70.05)，不同大写字母表示差异极显著(&<0.01)，不同小写字母表示差异显著(&<0.05)
3讨论
3.1湖羊、藏羊、蒙古羊、阿勒泰羊和多浪羊FecB 基因的体遗传结构分析
大多数学者研究表明，在湖羊上存在FecB基因多态位点并存在BB、B+和++三种基因型，且该位点与湖羊的产羔数呈显著相关(&<0.05)，以上结论与本试验结果一致［22-24］o FecB基因在藏羊［25\蒙古羊1269271和阿勒泰羊［28-29］上的研究结果显，3个品种都有B+及++两种基因型，但是B型等位基因频率相对低，此研究结论与研究所得一。史洪才削利用PCR-RFLP技术研究多浪羊FecB多态性时发现，在多浪羊FecB基因中存在BB、B+和++三种基因型，其基因型频率分别为0.005、0.146和0.849。阿布来提•苏来曼等［31］在多羊中发现了FecB基因的多态性！32"
在多羊中FecB基因的多态性。研究，多羊中存在FecB基因的多态性，B 型等位基因不高。本研究发现，多浪羊中FecB基因不存在多态性，可的因多羊品种本量较小，因此，为进一步研究多浪羊FecB基因的多态性进一大本进行。
在本研究中，湖羊、藏羊、蒙古羊、阿勒泰羊及多浪羊BB B+++基因型0.690.28 0.03,0.00、0.13、0.88,0.00、0.08、0.92,0.00、0.08、0.92和0.00、0.00、1.00；B等位基因频率由高到低依次为湖羊>藏羊>蒙古羊=阿勒泰羊>多羊。湖羊、藏羊、蒙古羊和阿勒泰羊的He和PIC分别为0.29、0.25,0.12、0.11,0.08、0.07和0.08、0.07。体PIC及He大小反映
异，大，明体多性，大。湖羊在该位点分表中多态，表明FecB基因多态性较高，异较大，可性状与标记
间连锁分析的。
3.2湖羊、藏羊、蒙古羊、阿勒泰羊和多浪羊FecB 基因多态性与产羔数的关系
大多数学者研究表明，多数绵羊体中该位点的B基因突变是增加繁殖力的“主效基因”⑺8，11，15,33"。李达等［29］研究，湖羊和阿勒泰羊中该位点BB基因型产羔数++基因型多1.174,B+基因型的产羔数较++基因型多1.016只，同时差异均达极显著水平(P<0.01)。本研究结果显示,FecB基因位点对湖羊及阿勒泰羊产羔数,B位基因。!3"研究，
FecB与绵羊产羔数呈显著或者极显著相关(P<0.05或P<0.01)，能用于绵羊人工选育过程中改善其繁殖力的分。
本研究对FecB多态性和绵羊产羔数的关联性研究，在湖羊、藏羊、蒙古羊和阿勒泰羊中BB基因型和B+基因型个体产羔数比++基因型高(P<0.01),BB基因型及B+基因型之间无差异(P>0.05)，表明FecB极显著绵羊产羔数(P<0.01)。在高、湖羊、藏羊、阿勒泰羊蒙古羊中B位基因0.89、0.74,0.16、0.00,0.06、0.00和0.06、0.02，其中，湖羊B等位基因频率显著高于其他体(P<0.05)，且同一种内高产羔绵羊体B位基因产羔体要高。
4结论
本研究结果表明，FecB基因位点在湖羊、藏羊、蒙古羊和阿勒泰羊中存在多态性，而多羊该。在高产羔体中B等位基因产羔体高，由高湖羊>藏羊>蒙古羊=阿勒泰羊>多羊。FecB基因++基因型个体产羔数极显著低于BB基因型个体和B+基因型个体(P<0.01),BB基因型个体与B+基因型个体间无显著差异(P>0.05)，表
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