DNA分子标记技术及其应用
白玉　(首都师范大学生命科学学院，北京100037)
摘要　对RF LP、RAPD、AF LP、SSR、ISSR等常用的DNA分子标记技术以及其他几种新兴的标记技术(S NP、EST等)的原理、特点进行了综述，认为利用DNA分子标记技术来鉴定品种具有客观、准确、快速的特点，且可鉴定形态上很难或者根本无法鉴别的品种。分子标记技术已成为品种鉴定技术领域的主流和发展趋势。
关键词　DNA分子标记;RF LP;RAPD;AF LP;SSR;ISSR；品种鉴定
中图分类号　Q503  文献标识码　A  文章编号　0517-6611(2007)24-07422-03
  遗传标记(G enetic marker)是指可追踪染体、染体某一节段或者某一个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有2个基本特征，即可遗传性和可识别性。因此，生物中任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。随着遗传学的不断发展，遗传标记的种类和数量也不断增加。目前，应用较为广泛的遗传标记有形态标记(M orph ologi2 cal maker)、细胞标记(Cytological maker)、生化标记(Biochemical maker)和分子标记(M olecular maker)[1]。
形态标记指植物的外部形态特征(矮秆、紫鞘、卷叶等)；细胞标记主要是染体的核型(染体数目、结
构、随体有无、着丝粒位置等)和带型(C带、N带、G带等)；生化标记主要包括同工酶和等位酶标记。这3种标记都是基因表达的结果，是对基因的间接反映，标记数目有限，多态性较差，易受环境条件的影响。而分子标记是直接在DNA分子上检测生物间的差异，是在DNA水平上遗传变异的直接反映。分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式，它以蛋白质、核酸分子的突变为基础，检测生物遗传结构与其变异[2]。分子标记技术从本质上讲，都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。DNA分子标记能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，不受环境及基因表达与否的限制。
1　分子标记及其特点
分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式，它以蛋白质、核酸分子的突变为基础，检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲，都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围，但就一般意义而言, DNA分子标记与形态标记和生化标记等相比，具有许多独特的优点[3]:①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译)，而不改变基因结构即DNA的核苷酸序列。③标记数量多，遍及整个基因组。
④多态性高，自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性，能够鉴别纯合基因型和杂合基因型，提供完整
作者简介　白玉(1983-)，女，河北邢台人，硕士研究生，研究方向：功能基因组。
收稿日期　2007204214的遗传信息。⑥DNA分子标记技术简单、快速、易于自动化。
⑦提取的DNA样品，在适宜条件下可长期保存，这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。
因此,DNA分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题，因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。
1.1　第1代分子标记
1.1.1　RF LP标记技术。1980年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polym orphisms,RF LP)可以作为遗传标记，开创了直接应用DNA多态性的新阶段，是最早应用的分子标记技术[4]。RF LP是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，反映DNA分子上不同酶切位点的分布情况，因此DNA序列上的微小变化，甚至1个核苷酸的变化，也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生，导致酶切片段长度的变化。RF LP标记的等位基因具有共显性的特点，结果稳定可靠，重复性好，特别适应于构建遗传连锁图。但是，在进行RF LP分析时，需要该位点的DNA 片段做探
针，用放射性同位素及核酸杂交技术，既不安全又不易自动化。另外,RF LP对DNA多态性检出的灵敏度不高, RF LP连锁图上还有很多大的空间区[2]。
1.1.2　RAPD标记技术。为了克服RF LP技术上的缺点, W illiams等[5]于1990年建立了随机扩增多态DNA(Rand om am plified polym orphic DNA,RAPD)技术，由于其独特的检测DNA多态性的方式使得RAPD技术很快渗透于基因研究的各个领域。RAPD是建立于PCR基础之上的分子标记技术，基本原理是利用一个随机引物(8～10个碱基)通过PCR反应非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究[6]。对任一特定引物而言，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。与RF LP相比,RAPD技术简单，检测速度快,DNA用量少，实验设备简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先克隆标记或进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构，合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，而且不需要同位素，安全性好。当然,RAPD技术受许多因素影响，实验的稳定性和重复性差[7]，首先是显性遗传，不能识别杂合子位点，这使得遗传分析相对复杂[8]，在基因定位、作连锁遗传图时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距离的准确性
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2007,35(24):7422-7424                  　责任编辑　孙红忠　责任校对　李洪
dna多态性下降；其次,RAPD对反应条件相当敏感，包括模板浓度、M g2+浓度，所以实验的重复性差[9]。
1.1.3　AF LP标记技术。扩增片段长度多态技术(AF LP)，又名限制片段选择扩增技术(S elective restriction fragment am plifi2 cation,SRFA)，于1993年由荷兰KEYGE NE公司的Z abean和V os等发明[10]，并已申请专利。AF LP是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术，它将基因组DNA用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补)连接起来，并通过5′端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA片段，从而形成指纹图谱的分子标记技术。AF LP指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。它兼具RAPD与RF LP的优点，有较高的稳定性，用少量的选择性引物能在较短时间内检测到大量位点，并且每对引物所检测到的多个位点都或多或少地随机分布在多条染体上，各染体上AF LP标记的数目与染体长度呈正相关(r=0.501)，而一对引物获得的标记涉及的染体数与标记数呈正相关(r=0.826)。因此，通过少量效率高的引物组合，可获得覆盖整个基因组的AF LP标记[11]。目前,AF LP作为一种高效的指纹技术，已在遗传育种研究中发挥它的优势[12]。不过也有研究认为, AF LP对基因组纯度和反应条件要求较高[13]，另外用于遗传作图时，少数的标记与图谱紧密度有出入[11]。此外，在RAPD和RF LP技术基础上建立了SC AR(S equence characterized am plified regions，序列特异性扩增区域)、C APS(C leaved am pli2 fied polym orphic sequence，酶切扩增多态序列)和DAF(DNA am2 plified fingerprints,DNA扩增指纹)等标记技术[14]。这些技术的出现，进一步丰富、完善了第1代分子标记技术，增加了人们对DNA多态性的研究手段。
1.2　第2代分子标记
1.2.1　SSR标记技术。在真核生物基因组中存在许多非编码的重复序列，如重复单位长度在15～65个核苷酸的小卫星DNA(M inisatellite DNA)，重复单位长度在2～6个核苷酸的微卫星DNA(M icrosatellite DNA)[3]。小卫星和微卫星DNA分布于整个基因组的不同位点。由于重复单位的大小和序列不同以及拷贝数不同，从而构成丰富的长度多态性。M oore等于1991年结合PCR技术创立了SSR(S im ple sequence repeat，简单重复序列)标记技术。SSR也称微卫星DNA，是一类由几个(多为1～5个)碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其中最常见的是双核苷酸重复，即(C A)n和(TG)n，每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10～60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。SSR标记的基本原理：根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。由于核心序列重复数目不同，因而扩增出不同长度的PCR产物，这是检测DNA多态性的一种有效方法。微卫星序列在体中通常具有很高的多态性，而且一般为共显性，因此是一类很好的分子标记。目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、水稻、小麦、玉米等物种的染体遗传图谱。这些微卫星标记已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、农作物育种、进化研究等领域[15]。此外,SSR标记不仅能够鉴定纯合体和杂合体，而且结果更加可靠，方法简单，省时省力。
1.2.2　ISSR标记技术。ISSR即内部简单重复序列，是一种新兴的分子标记技术。1994年Z ietkiewicz等
对SSR技术进行了发展，建立了加锚微卫星寡核苷酸(Anch ored microsatellite olig onucleotides)技术[14]。他们用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物，即在SSR的5′端或3′端加上2～4个随机选择的核苷酸，这可引起特定位点退火，从而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为ISSR(Inter2sim ple sequence repeat)[16]、ASSR (Anch ored sim ple sequence repeats)[17]或AMP2PCR[18]。在所用的两翼引物中，可以一个是ASSR引物，另一个是随机引物。如果一个是5′端加锚的ASSR引物，另一个是随机引物，则被称为RAMP技术[19]。
用于ISSR2PCR扩增的引物通常为16～18个碱基序列，由1～4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5′或3′末端结合，通过PCR反应扩增SSR之间的DNA片段。SSR在真核生物中的分布是非常普遍的，并且进化变异速度非常快，因而锚定引物的ISSR2PCR可以检测基因组许多位点的差异。与SSR2PCR相比，用于ISSR2PCR的引物不需要预先的DNA测序，也正因如此，有些ISSR引物可能在特定基因组DNA中没有配对区域而无扩增产物，通常为显性标记，呈孟德尔式遗传，且具有很好的稳定性和多态性。
1.3　第3代分子标记
1.3.1　S NP标记技术。单核苷酸多态性(S ingle nucleotide polym orphism,S NP)被称为第3代DNA分子标记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异，这种差异包括单个碱基的缺失或插入[20]，
更常见的是单个核苷酸的替换，且常发生在嘌呤碱基(A与G)和嘧啶碱基(C与T)之间。S NP标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异，被认为是应用前景最好的遗传标记。目前，已有2000多个标记定位于人类染体上，在拟南芥上也已发展出236个S NP标记。在这些S NP标记中大约有30%包含限制性位点的多态性。检测S NP的最佳方法是DNA芯片技术，最新报道的微芯片电泳(M icrochip electroph oresis)，可以高速度地检测临床样品的S NP，它比毛细管电泳和板电泳的速度可分别提高10和50倍[21]。S NP与第1代的RF LP及第2代的SSR标记的不同有2个方面：其一,S NP不再以DNA片段的长度变化作为检测手段，而直接以序列变异作为标记；其二,S NP标记分析完全摒弃了经典的凝胶电泳，代之以最新的DNA芯片技术。
1.3.2　EST标记技术。表达序列标签(E x pressed sequence T ag,EST)是美国国立卫生研究院(National Institutes of Health, NIH)的生物学家Venter于1991年提出的[22]。随着人类基因组计划的开展,EST技术首先被广泛应用于寻人类新基因，绘制人类基因组图谱，识别基因组序列编码区等研究领域，之后又被广泛应用于植物基因组研究[23]。EST是指在来源于不同组织的cDNA文库中随机挑选克隆、测序，得到部分cDNA序列，一个EST对应于某一种mRNA的cDNA克隆的一段序列，长度一般为150～500bp，只含有基因编码区域。EST
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可代表生物体某种组织某一时间的一个表达基因，所以被称之为“表达序列标鉴”；而EST 的数目则显示出其代表的基因表达的拷贝数，一个基因的表达次数越多，其相应的cDNA 克隆越多，所以通过对cDNA 克隆的测序分析可以了解基因的表达丰度[24]。目前构建cDNA 文库一般都使用试剂盒，方法成熟，而且飞速发展的DNA 测序技术，也使得进一步降低大规模DNA 序列测定成本成为可能[25]。
2　分子标记在品种鉴定中的应用
DNA 分子标记从它诞生之日起，就引起了生物科学家极
大的兴趣，在经历了短短几十年的迅猛发展后，分子标记技术日趋成熟[26]。早期，人们采用形态学方法对品种进行识别，其方法简便、经济，但是由于许多形态学性状鉴定周期长，受环境影响大，并且随着育种亲本的利用集中化，使得所选育的新品种在许多性状上更加相似，而难以区分，品种鉴定愈来愈困难。20世纪后期，分子生物学技术得到迅猛发展，而使从DNA 分子的角度准确可靠地对品种进行基因鉴定和纯度分析成为可能。与传统的田间形态鉴定相比较,
DNA 分子标记的应用为品种鉴定和纯度分析提供了客观、准
确、快速的渠道，是一项革命性的技术进步。
分子标记广泛存在于基因组DNA 的各个区域，数量巨大，通过对随机分布于整个基因组的分子标记的多
态性进行比较，就能够全面评估研究对象的多样性，并揭示其遗传本质。利用遗传多样性的结果可以对物种进行聚类分析，进而了解其系统发育与亲缘关系[2]。分子标记的发展为研究物种亲缘关系和系统分类提供了有力的手段。
3　展望
DNA 分子标记技术的开发是近年来分子生物学领域研
究的热点。随着分子生物学理论与技术的迅猛发展，必将不断地开发出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子标记。而分子标记技术与DNA 提取程序化、电泳胶片分析自动化、信息(数据)处理计算机化的结合，必将加速遗传图谱的构建、基因的定位及克隆、物种亲缘关系鉴别及与人类相关的致病基因的诊断和分析。参考文献
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