DNA抽提缓冲液（lysis buffer）：50mM Tris-Hcl（Ph7.2）
50mM EDTA
3% SDS
1% β-巯基乙醇（用时加）
饱和酚：氯仿（V：V,1：1）
异丙醇
3M醋酸钠NaOAc（Ph8.0）
1．称取0.075－0.085g干菌丝置于预冷的研钵中，加入液氮研磨至细粉末状，迅速转至1.5ml的离心管中并加入750μl DNA提取缓冲液（65℃预热），在振荡器上振荡几秒钟充分混匀，然后放到65℃水浴锅中水浴60min，每10min摇动一次。
2．加入750μl饱和酚：氯仿（V：V,1：1）轻轻颠倒离心管数次充分混匀，室温下12000rpm离心15min，取上清液置于新的离心管中。
3．加入1/30体积的3M醋酸钠NaOAc（PH8.0）和0.54体积的异丙醇，轻轻混匀后置于4℃冰箱中30min，室温下12000rpm离心2min，小心倒掉上清液，然后用冷的70％乙醇洗涤沉淀两次（轻轻颠倒离心管若干次），倒掉乙醇。
4．将装有DNA沉淀的离心管置于真空干燥器中，干燥约30min（时间以DNA变干为准）。
5．加入500μl的ddH2O溶解DNA沉淀，同时加入1－2μl RNase（终浓度为20μg/ml）,37水浴60min。
6．加入等体积的饱和酚：氯仿（V：V,1：1），充分混匀，然后室温下12000rpm离心15min，取上清液置于新的离心管中。
7．重复步骤3。
8．重复步骤4。
9．加入100ml TE溶解DNA，待完全溶解后置于－20℃冰箱中备用。
关于基因组酶切：每次切100 ul 体系，79 ul DNA，（浓度200微克以上），单酶切的话酶7微升，buffer 14ul，酶切5小时或者过夜都可以。。。。
Q1：Southern杂交的基本原理是什么？应用范围？
原理：其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。基因组DNA首先用一种或几种限制性内切核酸酶消化，消化后的片段通过标准琼脂糖电泳按照大小进行分离。然后DNA经过原位杂交，从胶上转移到固相支持物上（通常是尼龙膜或硝酸纤维素膜）。附着于膜上的DNA可以与标记的DNA、RNA或者寡核苷酸探针杂交，通过特定的检测方法如放射自显影可以确定与探针互补的带的位置。通过对经过不同限制性内切核酸酶（单一的或联合使用的）消化过的基因组DNA、产生的条带的大小以及数量的估计，可以判断靶基因上下游限制性内切核酸酶的位置。
应用范围：利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。
Q2：Southern杂交技术与PCR检测技术相比，优缺点是什么？
Southern杂交技术：
优点：方法灵敏，在理想条件下，用放射性同位素标记的探针和放射自显影技术，即便每条电泳带仅含2ngDNA也能被清晰地检测出来。。
缺点：主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。Southern杂交要求的DNA纯度高。
PCR产物检测：
优点：PCR方法简单，容易操作；DNA纯度要求不是很高。
缺点：需要目标片段上、下游引物，通过扩增+琼脂糖电泳，会在指定的位置显现出来。
Q3：DNA提取过程中使用的CTAB的化学性质是什么？在DNA提取过程中作用？
100mMTris-7.5：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
700mMNaCL：NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中。
50mMEDTA (8.0)：EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性
1%CTAB：CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
140mMβ-巯基乙醇：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA。
Q4：DNA提取过程中，β-巯基乙醇、苯酚/氯仿/异戊醇、异丙醇与乙醇等试剂的作用分别是什么？
β-巯基乙醇：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA。
苯酚/氯仿/异戊醇：反复抽提DNP（脱氧核糖核蛋白复合体），除去蛋白质。
异丙醇与乙醇：乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
Q5：DNA提取质量评估的方法有哪些，分别有什么优缺点？如何定量DNA？
1,DNA液测定230nm、260nm及280nm处的光吸收，OD260/OD280 比值大于2.0 ，表明有RNA污染；小于1.8 ，表明有蛋白质、酚等杂质。OD260/OD230比值大于2.0表明无小分子和盐类杂质干扰。这样的方法其它的杂质对测量结果影响大一点，因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收。
2，荧光法，用PicoGreen荧光染料，测定DNA，RNA浓度比较灵敏，并且适合测量低浓度和微量DNA和RNA，并且受其它杂质的影响不大，缺点要有专门的荧光检测仪器，试剂比较昂贵。
Q6：什么是DNA限制性内切酶？高等植物基因组DNA完全酶切后产物在变性分离胶中分布与形态是什么？DNA电泳的基本原理是什么？
内切酶是最关键的工具酶，是一类具有严格识别位点，并在识别位点内或附近切割双链DNA的脱氧核糖核酸酶。
高等植物基因组DNA完全酶切后产物在变性分离胶中分布与形态是：酶切完全的DNA进行琼脂糖凝胶电泳没有明显主带，呈弥散状，而且DNA在泳道中分布中间多，两头少DNA电泳的基本原理：在电场的作用下，带有负电荷的DNA链，依靠无反应活性的稳定的
介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，以一定的迁移率从负极移向正极。根据
核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物
中的不同成分彼此分开。DNA分子的迁移速度与其分子质量的对数值成反比关系。当用EB对DNA样品染时，加入的EB就插入DNA分子中形成荧光结合物，荧光的强度与DNA含量成正比，如果用DNA片段的标准品作电泳对照，就可以估计出待测样品的分子量大小和浓度。
Q7：TAE与TBE缓冲液系统有什么差异？应用的异同点？
TAE是Tris-乙酸，缓冲容量小，但是溶解度大，易于储存TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大，但是溶解度小，不易长期储存，易产生沉淀。
TAE 与TBE 缓冲溶液的成份如下：
50x TAE Buffer (Tris-Acetate-EDTA)
242 g    Tris base
57.1 ml    Acetic acid 100ml
0.5M EDTA
Add ddH2O to 1 liter and adjust pH to 8.5.
10x TBE Buffer (Tris-Borate-EDTA)
108 g    Tris base
55 g    Boric acid
9.3 g  Na4EDTA
Add ddH2O to 1 liter.
The pH is 8.3 and requires no adjustment.
TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁
移率较TBE缓冲液快，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电
泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。
TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非
共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。
Q8：简述虹吸法转膜的基本原理与物理学过程。
利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。
DNA片段由液体携带而从凝胶转移并聚集于薄膜表面。液体通过毛细管作用抽吸通过凝胶，借助于一叠干的吸水纸巾产生并维持毛细管作用。转移的速度取决于DNA片段的大小和凝胶中琼脂糖的浓度，小片段DNA（<1kb）1h内就能够从0.7%琼脂糖上几乎定量地转移，
而较大片段的DNA转移较慢且效率较低。
Q9：概述DNA变性与复性的过程。为什么在转膜前要进行变性与复性？
1.变性加热、低盐及强酸、强碱均可使DNA变性。①DNA双链之间以氢键连接，氢键是一种次级键，能量较低，易受破坏，在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间
的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即为DNA变性。DNA变性只涉及二级
结构改变，不伴随一级共价键的断裂。②DNA在紫外区260nm波长处的吸收光值变化。
2.复性变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，这种现象称为复性。
变性与复性的作用：为了进行有效地实现Southern印迹转移，对电泳凝胶做预处理十分必要。分子量超过10kb的较大的DNA片段与较短的小分子量DNA相比，需要更长的转移时间。所以为了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNA片段控
制在大约2kb以下。DNA的大片段必须被打成缺口以缩短其长度。因此，通常是将电泳凝胶浸泡在0.25mol/L 的HCl溶液短暂的脱嘌呤处理之后，移至于碱性溶液中浸泡，使DNA 变形并断裂形成较短的单链DNA片段，再用中性PH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。这样，DNA片段经过碱变性作用，亦会使之保持单链状态而易于同探针分子发生杂交作用。
Q10：虹吸法转膜过程中注意事项是什么？
1，转移时，凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严，防止在转移过程中产生短路，影响转移效率，同时注意膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡，以免影响转移。
2，凝胶、膜、吸水纸大小要适中，差不多大，不能太大，防止造成短路。并且各层之间不能有气泡；,
3，凝胶、膜都要做好标记，不能搞混；
4，整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。
Q11：随机标记探针是分别利用什么酶的什么活性来实现的？
通过Klenow酶的5'→3'聚合酶活性。
Q12：洗膜等过程中用到的SSC分别指什么？洗膜等过程中的严谨性高低可以通过怎么的
浓度来实现？分别利用了这些物质的哪些物理与化学性质？
SSC（saline sodium citrate）缓冲溶液是分子生物学中最标准的印迹和杂交处理溶液，其含有Sodium Chloride，Sodium Citrate。
洗液I（2×SSC/0.1%SDS，1L）
20×SSC 100ml，
10% SDS 10ml
ddH2O定容至1L
洗液II（0.5×SSC/0.1%SDS，1L）
20×SSC 25ml，
10% SDS 10ml
ddH2O定容至1L
洗液III（0.1×SSC/0.1%SDS，1L）
20×SSC 5ml，
10% SDS 10ml
ddH2O定容至1L
主要用于核酸杂交，不同浓度作用不同：常用2×，及0.5×
·SSC缓冲液中的盐离子（Na ）中和DNA/DNA主链上的负电荷，使其呈电中性，这样可以使探针和把序列的结合比较容易进行。
·2×SSC：高盐洗膜，洗去部分非特异性结合的探针。
·0.5×SSC：低盐洗膜，增加核酸链的严紧性，使得DNA/DNA之间的排斥力增加。
Q13：洗膜过程中的注意事项。
用不同组成及离子强度的（严谨度）溶液，洗去膜上的封闭剂及非特异性杂交的探针
1，从低严谨度到高严谨度冼膜液。
2，每次漂洗时要调换膜的顺序，以使每张膜漂洗的一致。
3，在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一
步达到终点，都必须停止洗膜。
4，用滤纸将杂交膜上的洗液吸干，然后用保鲜膜包好（尽可能除去保鲜膜内的空气）。洗膜过程中切忌将膜干燥。
Q14：压磷屏时，应把杂交过的膜的哪个面朝向磷屏的哪个面？
杂交膜的正面朝向磷屏。
dna多态性Q15：影响Southern杂交的主要因素有哪些？
1，DNA提取的质量。
2，转膜的完全程度。
3，转膜的效率。
4，探针标记的效率。
5，杂交和洗膜的效率。
6，酶切效率、电泳分离效果、探针比活性和洗膜终止点等都影响southern杂交。

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