单核苷酸多态性在多基因遗传病研究中的作用
陈菁孙桂芹
绍兴市人民医院检验科
多基因遗传病是多对微效基因协同作用并与环境因素共同导致的疾病，与单基因疾病相比，多基因疾病涉及的易感基因数量多，发病原因也更为复杂。目前常见的肿瘤、心血管疾病、糖尿病等均为多基因遗传病，通常具有如下特点：（1）先证者的各级亲属发病率均高于体发病率；（2）家族性聚集倾向；（3）先证者之后出世的同胞发病率比其他亲属为高；（4）与先证者的亲缘关系越近，发病率越高；（5）先证者的父母为近亲婚配的比率稍高于普通体的近亲婚配率；（6）同卵双生的同病一致率高于异卵双生。某一遗传病如基本符合上述特征，而且其实际调查的患病先证者各级亲属发病率与上述预期的发病率间无显著性差异，就可确认该病遗传性质可能为多基因遗传病。人类多基因遗传病基因定位是采用以家系为基础的连锁分析（family-based linkage analysis），但是连锁分析已经难以解决所有的研究需要，随着单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）技术的快速发展，以SNP作为遗传图谱用于疾病易感基因定位的成为目前的研究趋势，如在某一体中设病人组和对照组，确定某一遗传标记的频率在两组中是否存在差别，即分析遗传基因型与性状基因间是否连锁不平衡，进而在该遗传标记附近寻目标基因，即所谓的关联分析。
SNP是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换（C与T互换，在其互补链上则为G与A 互换）或颠换（C与A，G与T，G与G，A与T互换）等变异所引起的DNA序列多态性。SNP是人类基因组中可遗传的变异，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数达300万个甚至更多，2001年“国际SNP作图工作组”已在人类的基因组中发现并定位了142万个SNP标记。SNP具有数量大，分布广，高度稳定，易于自动化分析的特点，SNP被普遍认为是继第一代限制性片段长度多态性标记、第二代微卫星即简短串联重复标记之后的第三代基因遗传标记。SNP是一种可以早期检测的突变，以SNP的高分辩率基因图作为全基因组连锁分析或关联分析的基础，检出不同个体或体对疾病的易感基因，可能同时筛选到复杂疾病或性状的众多相关基因等。因此SNP的在人类基因组研究中有非常重要的意义。
1．SNP与肿瘤易感性研究
肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病之一，绝大多数肿瘤为多基因遗传病，除外界环境因素影响，还涉及到多个遗传易感基因的作用。目前SNP作为反映个体遗传易感性差异的一个重要方面，它包括①通过对基因组的SNP连锁不平衡分析，将肿瘤易感相关基因进行定位②对肿瘤患者与正常对照人分析与该类型肿瘤相关的一个或几个易感基因的SNP，根据某SNP的某种基因型、单倍型频率在患者与正常对照人中的差异分布，从而确定某基因型或单倍型个体对该肿瘤的易感性。
1.1 DNA修复基因SNP与肿瘤易感性
各种物理、化学、生物的因素均可导致机体DNA的损伤，而这些DNA的损伤可能会改变某些基因的结构或功能，进而可能导致肿瘤的发生。为维持机体功能和遗传的稳定性，对外界因素导致的损伤机体有相应的修复系统进行修复，已知人类参与DNA修复的基因有130余种。DNA修复能力的缺陷会
导致个体遗传的不稳定性乃至癌症的发生，而个体或体间修复酶基因的遗传差异，可使不同个体对肿瘤易感性的产生差异。许多研究表明修复基因的SNP与肿瘤易感存在一定的关系。
DNA修复基因与肺癌易感性关系的研究中，研究者发现不同修复基因的SNP与肺癌存在一定的相关性。Ratnasinghe等分析碱基切除修复基因XRCC1发现Arg280His位点多态性与肺癌危险性的增加显著相关（OR=1.8；95%CI=1.0～3.4）。朱锦富等研究核苷酸切除修复基因XPA A23G多态性可能与中国汉族人肺癌遗传易感性有关，发现与携带XPA 23AA基因型者相比较，携带至少一个23G等位基因（即23GG和23AG基因型）的个体肺癌风险降低。Popanda等进行的463名肺癌病例与460名非肿瘤对照病例的研究结果显示，XPD 751Gln/Gln基因型的个体患肺癌的危险性升高。
另有研究表明：hOGGI（A1165G）的GG基因型、XRCC3（Thr241 Met）的Met/Met基因型LIG4（T1977C）的T等位基因，分别增加个体患前列腺癌、乳腺癌的风险。携带有此种基因型或单倍型的个体更易患病，这些特异性标记可以作为判断个体某肿瘤易感性的分子标记，从而可确定患某肿瘤的高危人。
1.2 癌基因、抑癌基因SNP与肿瘤易感性
癌基因和抑癌基因突变是肿瘤发生发展中出现频率较高，突变的结果使癌基因激活、抑癌基因失活，导致细胞表型发生变化和肿瘤的发生。而Hilyama研究了抑癌基因P53密码子72 SNP（Arg/Pro）与H.pylori-CG（Helicobacter pylori-associated chronic gastritis）弥散性胃癌的相关性，结果表明与Arg/Arg基因型相比，Pro/Pro基因型个体患病风险提高29.8%，这意味着可以将其作为一个易感性评估标记。
1.3 代谢酶基因SNP与肿瘤易感性
研究表明，体内多种代谢酶基因的多态性与某些肿瘤的高发有一定关系。由于这些酶系统中基因的多态性使酶的功能存在差异，从而个体对环境致癌物的反应存在个体差异，如将致癌物转化或代谢的能力不同，使得对某肿瘤的反应也存在易感差异。代谢酶基因CYP1A1 SNP（Ile/Va1）的Val/Val 基因型使个体患食管鳞状细癌的易感性增加。Matsuo研究乙醛脱氢酶ALDH2基因的一个SNP （Glu487Lys）与结肠直肠癌易感性的关系，发现487Lys等位基因与此酶的活性缺失有关，对于直肠癌而言，饮酒因素对Glu/Lys基因型个体比Glu/Glu基因型个体有更高的风险。
2．SNP与心血管疾病
dna多态性心血管疾病是当代社会危害人类健康的重大疾病，包括冠心病、高血压、动脉硬化等，这类疾病亦为多基因遗传病，如原发性高血压呈现遗传易感性与环境因素相结合的发病模式。
2.1 SNP与冠心病
国外的一些分子流行病学研究表明，三磷酸腺苷结合盒转运子A1（ATP binding cassette transporter 1，ABCA1）基因常见多态性与血浆脂质水平和CHD易感性存在一定的关联性，其中R219K 及M883I多态性在不同人中表现为与降低的CHD危险性相关联。孙屏等探讨江苏汉族人冠心病患病风险和ABCA1基因R219K及M883I多态性的关系，发现与携带219RR基因型者比较，携带至少1个219K 等位基因者（即RK和KK基因型）冠心病患病风险显著降低59%（OR=0.41，95%CI=0.27～0.61）。而在883位点，II基因型携带者患冠心病率较低（OR=0.54，95% CI=0.26～1.11）。而两位点联合作用分析发现与携带219RR，883MM或883MI基因型者相比较，携带其他组合基因型的个体冠心病患病风险降低61%（OR=0.39，95%CI=0.26～0.60）。低血清HDL-C水平是发生冠心病一个主要的独立的危险因
子。另外，对照组中携带219K等位基因者血清HDL－C水平显著高于219K非携带者（P=0.037），提示Arg219Lys位点的多态改变主要通过改变HDL－C水平影响个体冠心病的患病风险。钱高潮等研究上海汉族人中凝血酶调节蛋白（thrombomodulin，TM）基因1418位C/T多态性与冠心病（CHD）的关系，检测的48例CHD患者中T/T 22例，C/T 23例，C/C 3例；TM基因1418位SNPs基因型频率和基因频
率在CHD患者和正常对照者中分布差异无显著性（P>0.05）。刘合焜等探讨中国人载脂蛋白C3基因（APOC3）Sst I点（S1/S2）单核苷酸多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease，CHD）合并高甘油三酯血症（HTG）的相关性，结果表明APOC3基因Sst I多态位点S2等位基因与CHD合并HTG、NIDDM合并HTG相关，S2等位基因增加了CHD对HTG的易感性。
2.2 SNP与高血压
人中30%～50%血压变异是由遗传因素决定的，高血压是人类心脑血管疾病中危害最大的一种多基因疾病。无论是继发性高血压还是原发性高血压，它们都在分子水平存在影响高血压发生的易感基因。影响血压的基本因素有二个：血管阻力和心输出量，血管阻力和血容量则是引起高血压的直接原因。
2.2.1 血管紧张素受体基因
肾素－血管紧张素－醛固酮系统在维持体内的电解质平衡及血管的抗性方面有十分重要的作用。血管紧张素II（Ang II）是强烈的缩血管因子和醛固酮分泌调节因子，它在血压控制和循环血容量的调节中发挥着重要的作用。AT1和AT2是是介导血管紧张素血管活性的主要受体。AT1主要分布在血管细胞和肾脏及肾上腺，介导Ang II的主要生理作用。张奎星等报道血管紧张素II 1型受体，发现A-153G多态性的G等位基因在高血压合并冠心病组中频率比对照组明显增高，基因－153位A被G 取代可能与华东汉族人原发性高血压合并冠心病相关。应用直接测序的方法在随机选择的20例男性高血压（EH）中对血管紧张素II 2
型受体基因作SNP的筛查，同时在96例EH男性患者和107例正常对照男性人中评价这些SNP与EH的关系，对其中的2个SNP（A1675G和T1334C）进行病例对照研究，发现A1675G位点上男性EH患者中A等位基因频率与正常对照组相比差异有统计学意义（EH组A等位基因频率为49.0%，正常组为34.6%，P<0.05）。因此推断血管紧张素II 2型受体基因的A1675G单核苷酸多态性可能与山东地区男性EH患者相关。
2.2.2 β-肾上腺素受体基因
目前研究报道，普遍认为β1肾上腺素能受体（β1-AR）基因存在2个SNP，一个位点在145（A-G），编码49位氨基酸由Ser变成Gly（Ser49Gly），另一个位点1165（G-C），相应389位氨基酸由Gly变成Arg（Gly389Arg）。Bengtsson等对292名高血压患者和265名健康者进行对照研究，Arg389Arg基因型与Arg389等位基因频率在高血压组显著高于正常对照组（P=0.0003），校正了年龄、性别和体重指数后，这一差异仍存在。
β2-肾上腺素受体（β2-AR）是交感神经系统的重要组成部分，通过改变血管紧张性，调节肾素释放，影响水盐代谢等途径调节血压，对血压的短期和长期调节均有重要的影响。吴弘等检测β2-AR 基因编码区部分序列SNP研究结果显示，+252位A-C（X2＝6.02，P<0.05）和+1239位的SNP在高血压人和正常血压人的多态性分布有显著性差异，提示该位点与高血压相关。
2.2.3 内皮NO合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）
血管内皮细胞产生的NO，主要用来调节血压和局部血流。研究表明，内皮细胞NO合成酶与冠心
病和高血压的发生有一定关系。马厚勋等分析汉族人一氧化氮合酶基因NOS3 A-922G、NOS3 T-786C 与NOS3 G894T单核苷酸多态性的等位基因及其组合分布与高血压病的相关性，组合分布研究发现，一氧化氮合酶基因NOS3G894G+A-922G+T-786C的组合基因型分布频率在高血压病女性亚组较健康女性亚组明显减低，提示携带该组合基因型女性人可能不易息高血压病。NOS3基因Glu298Asp突变可能是中国人原发性高血压病的一种遗传易感指标。
3．SNP与糖尿病
涉及糖尿病的基因可能有几个、几十个、甚至几百个，即使同时存在几个易感基因也仅仅增加患病的危险性而并不一定发病。2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）是一种复杂的多基因遗传疾病，胰岛B细胞胰岛素分泌不足和（或）胰岛素靶组织细胞发生胰岛素抵抗是其主要致病原因，环境因素也是致病因素之一。T2DM存在遗传异质性或基因外显不全，导致其易感基因的组合有种族、地区、甚至家系的差异。以往研究结果显示，在1号染体上有3个区域（1p36.33～36.23、lq24.3～25.1及lq42.12～42.13）与2型糖尿病有显著连锁关系，尤其是lp36.33～36.23区域。
李义等以236例2型糖尿病和无血缘关系的152例正常标本进行SNP基因分型及病例对照关联分析，结果124个SNP位点中有4个SNP位点的分布频率在病例组和正常对照组存在显著差异（P<0.05），分别为sAC基因中的rs203849（P=0.005，OR=1.60）和rs203826（P=0.016，OR=1.60），PANK4基因中的rs7535528（P＝0.028，OR=1.45）和CASP9基因中的rs884363（P=0.043，OR=1.37），提示sAC、PANK4和CASP9基因为中国北方汉族人2型糖尿病候选易感基因。非溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族的Calpain-10基因（CAPN-10）编码半胱氨酸蛋白酶CAPN-10，参与细胞凋亡、增殖、分化等过程，调节细胞内信号传导，脂肪细胞分化以及胰岛素诱导的胰岛素受体-1（IRS-1）下调。Cox等报道了CAPN －10基因的单核苷酸多态性与T2DM呈显著相关；另有研究者也阐述了CAPN-10 SNP43、SNP19与T2DM 遗传易感性的关系。Baier等研究发现，GG基因型者，骨骼肌中CAPN-10mRNA表达减少，胰岛素介导的葡萄糖摄取率下降，胰岛素抵抗增强，从而可能增加了2型糖尿病的易感性。
肥胖者中发生高血压的几率较高，目前的研究结果提示抵抗素介导肥胖者的胰岛素抵抗，抑制脂肪细胞分化。抵抗素也称为FIZZ3（found in inflammatory）和ADSF（adipose tissue-specific secretory factor），它特异性在脂肪组织表达，是一种多肽激素，由RSTN 基因编码。Engert等发现抵抗素两个启动子的多态性及5′末端（-537A>C和-420C> G）有明显的连锁不平衡，校正年龄和性别后，仍显示与升高的体重指数（BMI）和胰岛素敏感性有关（OR分别为2.72、1.58）。研究该基因的第三内含子发现+877位G/C的单核苷酸多态性，在T2DM 组和正常组的等位基因频率和基因型频率没有显著差异；而Os
awa等发现日本人抵抗素基因内含子3个SNPs与T2DM易感性无关，因而认为抵抗素基因在胰岛素抵抗中不是主效基因。孔令芳等胰岛素受体-2（IRS-2）基因G1057D突变携带DD基因型的非肥胖者胰岛素敏感性增高，而携带DD基因型的肥胖特别是中心性肥胖者的胰岛素敏感性却降低，提示IRS-2 G1057D突变以肥胖为中介与T2DM相关联。
综上所述，SNP在研究肿瘤、糖尿病、心血管疾病等多基因疾病方面，已发挥了积极有效的作用。目前，SNP的研究还处于发展阶段，对其的研究正在不断深入，仍有许多问题需要解决，但是随着SNP完整图谱的建立和检测技术的完善以及生物信息学的发展，其在分子遗传学、药物遗传学及法医学的研究中都将发挥重要的作用。

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