滇南小耳猪生长激素基因多态性研究
何保丽，角建林，陈丽玲，李波，李进涛，王利梅
（昆明医科大学实验动物学部，云南昆明６５０５０２）
［摘要］目的探讨滇南小耳猪生长激素基因多态性，为滇南小耳猪的选育提供分子标记辅助选择的依据．
方法
采用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ方法对滇南小耳猪ＧＨ基因的ＡｐａⅠ酶切位点多态性进行了分析．结果
检测到两种基因
型ＡＡ和ＡＢ，ＡＢ型的频率高子ＡＡ型．没有检测到ＢＢ基因型个体．等位基因Ａ的基因频率高于等位基因Ｂ，等位基因Ａ在体中占优势．结论滇南小耳猪生长激素基因具有较丰富的多态性．
［关键词］滇南小耳猪；生长激素基因；多态性
［中图分类号］Ｑ９５－３３［文献标识码］Ａ［文章编号］１００３－４７０６（２０１２）１１－００２３－０３
ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍｏｎｅＧｅｎｅｉｎ
ＤｉａｎｎａｎＳｍａｌｌ－ｅａｒＰｉｇ
ＨＥＢａｏ－ｌｉ，ＪＩＡＯＪｉａｎ－ｌｉｎ，ＣＨＥＮＬｉ－ｌｉｎｇ，ＬＩＢｏ，ＬＩＪｉｎ－ｔａｏ，ＷＡＮＧＬｉ－ｍｅｉ
（Dept.of Experimental Zoology ，Kunming Medical University ，Kunming Yunnan ６５０５００，China ）［Abs tract ］Objective Ｔｏｐｒｏｖｉｄｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｉｎＤｉａｎｎａｎｓｍａｌｌ－ｅａｒｐｉｇｔｈｒｏｕｇｈｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇｔｈｅｇｅｎｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ．Method ＴｈｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆｐＧＨｇｅｎｅｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇＰＣＲ－ＲＦＬＰａｔＡｐａⅠｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｌｏｃｉ．Results ＧｅｎｏｔｙｐｅｓＡＡａｎｄＡＢｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．ＴｈｅｆｒｅｙｕｅｎｃｙｏｆｇｅｎｏｔｙｐｅＡＢｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎＡＡ．ＧｅｎｏｔｙｐｅＢＢｗａｓｎｏｔｄｅｔｅｃｔｅｄ．ＴｈｅａｌｌｅｌｅＡｆｒｅｑｕｅｎｃｙｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎＢ，ＡｗａｓｄｏｍｉｎａｎｔｉｎＤｉａｎｎａｎｓｍａｌｌ－ｅａｒｐｉｇｃｏｌｏｎｙ．Conclusion ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｈａｓｇｅｎｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｉｎＤｉａｎｎａｎｓｍａｌｌ－ｅａｒｐｉｇ．
［Ke y words ］Ｄｉａｎｎａｎｓｍａｌｌ－ｅａｒｐｉｇ；Ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅｇｅｎｅ；Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
Journal of Kunming Medical University
昆明医科大学学报2012，（11）：23～25
［基金项目］云南省教育厅青年基金资助项目（０９Ｙ０１７６）
［作者简介］何保丽（１９７８～），女，云南马关县人，动物学硕士，实验师，主要从事实验动物分子与数量遗传研究工作．
猪生长激素（ｐｏｒｃｉｎｅｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ，ｐＧＨ）基因全序列由Ｖｉｚｅ等［１］首先克隆确定，由５个外显子和４个内含子组成，全长２２３１ｂｐ．近年来，国内外学者对ｐＧＨ基因的多态性做了大量的研究，但对滇南小耳猪的生长激素基因多态性研究尚少．滇南小耳猪是云南地方特有的猪种，因其体型小、半驯化、区域性封闭繁殖及基因纯合度高等品质而倍受实验动物学界的关注．本研究旨在通过对滇南小耳猪ＧＨ基因多态性研究，以期为探讨滇南小耳猪ＧＨ基因多态性与生长繁殖性状之间的关系提供理论基础，为今后滇南小耳猪的选育提供分子标记辅助选择的依据．
1材料与方法
1.1实验材料
实验所用材料为滇南小耳猪血液，采自昆明医科大学实验动物中心，随机抽取了自繁的滇南小耳猪２３头．前腔静脉采血２ｍＬ，ＥＤＴＡ－Ｋ２抗凝，－８０℃冻存备用．1.2方法
1.2.1基因组ＤＮＡ的提取基因组ＤＮＡ的提取参照ＳｕｋａｍｏｌＳｒｉｋｗａｎ等［２］的方法稍加改进．主要步骤：（１）冰冻血样室温融化，将７５０μＬ全血加入
CN 53-1221/R
第３３卷24昆明医科大学学报
１．５ｍＬ离心管中，加入等体积ＰＢＳ缓冲液，混匀１０ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清；（２）加入６００μＬＳＥＴ，混匀５～１０ｍｉｎ，３７℃水浴１ｈ；（３）加入蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ）至终浓度为１００μｇ／μＬ，充分混匀，再加入７０μＬＳＤＳ，于５６℃水浴温和振荡，消化过夜至不见粘稠团块；（４）加入等体积的Ｔｒｉｓ饱和酚、盖紧管盖、缓慢地来回颠倒混合至少１０ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心１０ｍｉｎ；（５）将上清转移至一新的灭菌离心管中，用Ｔｒｉｓ饱和酚重复抽提一次；（６）再向上清中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（２５：２４：１）混合液，缓慢颠倒离心管１０ｍｉｎ，使溶液两相充分混匀，１２０００ｒ／ｍｉ
dna多态性
ｎ、４℃离心１０ｍｉｎ；（７）转移上清至另一灭菌离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇（２４：１），同上再抽提一次；（８）向上清液中加入２．５倍体积的冰乙醇，加１／１０体积的３ＭＮａＡｃ（ｐＨ＝５．２），盖紧管盖、水平摇晃直到可看到絮状ＤＮＡ沉淀；（９）将ＤＮＡ沉淀挑出，置于１．５ｍＬ灭菌离心管中，加入１ｍＬ７０％的乙醇洗涤ＤＮＡ沉淀２次；１２０００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心１０ｍｉｎ；（１０）小心倒掉乙醇，将离心管倒扣于纸巾上，置于３７℃温箱干燥（１５ｍｉｎ左右）或自然凉干；（１１）待乙醇完全挥发尽，加入１００～２００μＬＴＥ（ＴＥ加入量视ＤＮＡ团的大小而定），４℃过夜以溶解ＤＮＡ．
1.2.2引物及ＰＣＲ反应条件用于生长激素基因为点ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析的引物参照经荣斌等［３］设计的引物序列，引物序列为：ｐｒｉｍｅｒ１：５＇－ＧＣＣＡＡＡＴＴＴ－ＴＡＡＡＴＧＴＣＣＣＴＧ－３＇；ｐｒｉｍｅｒ２：５＇－ＣＴＧＴＣＣＣＴＣＣＧ－ＧＧＡＴＧＴＡＧ－３＇．ＰＣＲ扩增的产物大小为５０６ｂｐ，产物位置在５＇上游区＋２９５￣＋３００ｂｐ区间．引物由上海生工生物工程有限公司合成．ＰＣＲ反应体系总体积为２５μＬ，反应混和液中１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ（含ＭｇＣｌ２２５ｍｍｏｌ）３μＬ，ｄＮＴＰ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）３μＬ，ｐｒｉｍｅｒ－１（１０ｐｍｏｌ／Ｌ）０．８，ｐｒｉｍｅｒ２（１０ｐｍｏｌ／Ｌ）０．８μＬ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．２μＬ，ＤＮＡＴｅｍｐｌａｔｅ（５０～１００ｎｇ／μＬ）１μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ至反应体积为２５ｍＬ．ＰＣＲ反应程序：９１℃预变性８ｍｉｎ，９２℃变性３５ｓ，６０℃退火４０ｓ，７４℃延伸３０ｓ，３０个循环，最后于７２℃下延伸８ｍｉｎ．
1.2.3ＰＣＲ扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测恒压１５０Ｖ，１×ＴＡＥ电泳缓冲液，５μＬＰＣＲ扩增产物混合１μＬ的琼脂糖凝胶上样缓冲液，２％琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ扩增是否成功．
1.2.4ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析ＰＣＲ产物酶切反应体系为：ＰＣＲ产物６μＬ，ｄｄＨ２Ｏ８μＬ，１０×ｂｕｆｆｅｒ１．５μＬ，ＡｐａⅠ限制性内切酶１．５μＬ．酶切产物用８％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，同时加入ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００作分子量标记．６０Ｖ电压，电泳１２ｈ．银染，显后的凝胶经凝胶成像分析仪扫描成像，并分析、判定等位基因扩增片断的大小．
1.2.5基因型分析ＰＣＲ产物的长度为５０６ｂｐ，ＡｐａⅠ限制性内切酶酶切ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳后，其基因命名方法见表１．
基因带型基因型命名
ＧＨ２８０ｂｐ／２２６ｂｐＡＡ
２８０ｂｐ／１３４ｂｐ／９２ｂｐＢＢ
２８０ｂｐ／２２６ｂｐ／１３４ｂｐ／９２ｂｐＡＢ
表1基因型判断标准
Ｔａｂ．1Ｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｓｉｚｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｅｎｏｔｙｐｅｓ
2结果
2.1血液基因组ＤＮＡ的提取结果
采用常规酚／氯仿抽提法提取猪的血液基因组ＤＮＡ，提取的基因组ＤＮＡ于０．７％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图谱见图１．
图1提取的基因组ＤＮＡ电泳图谱
Ｆｉｇ．1ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｐｉｇｂｌｏｏｄ
2.2ＰＣＲ扩增产物检测
ＰＣＲ扩增产物与２％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图谱见图２，由图可以看出，ｐＧＨ基因位点ＰＣＲ扩增特异性良好，产物片段大小与预期片段大小相符．
图2ＰＣＲ产物电泳图谱
Ｆｉｇ．2ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｓｆｏｒｐＧ－Ｈ
ｇｅｎｅ
１
５００
５００
３００
１００ＡＢＣＤＥＦＧＨＭ
何保丽，等．滇南小耳猪生长激素基因多态性研究25
第11期2.3酶切产物聚丙烯酰胺凝胶电泳
ｐＧＨ基因ＰＣＲ产物经限制性内切酶酶切后，于６％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳判定基因型，电泳图谱见图３．
2.4ＧＨ基因ＡｐａⅠ酶切位点多态性
根据酶切产物电泳图谱进行基因型判定，计算出滇南小耳猪选育ＧＨ基因的基因型频率、等位基因频率见表２．
由表２可以看出，经２３头猪血液样品检测，滇南小耳猪ＧＨ基因在＋２９５～＋３００区段的ＡｐａⅠ酶切位点只检测到两种基因型，即ＡＡ和ＡＢ，基因型频率分别为０．２１７４，０．７８２６，ＡＢ型的频率
比ＡＡ型高．没有检测到ＢＢ基因型个体．等位基因Ａ和Ｂ的基因频率分别为０．６０８７和０．３９
１３，等位基因Ａ的频率比Ｂ高
．
９２
２８０２２６１３４３ＣＤ２ＣＤ１ＣＤ
ＡＢ
ＡＢＡＢＡＡＡＡＡＢＡＢＭ
图3ＧＨ基因酶切产物电泳图谱Ｆｉｇ．3ＲＦＬＰｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆＧＨｇｅｎｅ
基因基因型个体数基因型频率等位基因
基因频率ＧＨＡＡ５０．２１７４Ａ０．６０８７Ａ
ＡＢ
１８
０．７８２６
Ｂ
０．３９１３
表2基因型频率与基因频率
Ｔａｂ．2Ｇｅｎｏｔｙｐｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓａｎｄｇｅｎｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ
3讨论
本研究通过对２３头滇南小耳猪血液样品分析发现，ＧＨ基因在＋２９５～＋３００区段的ＡｐａⅠ酶切位点等位基因Ａ在体中占优势，基因频率为０．６０７８，等位基因Ｂ在体中处于劣势．实验只检测到两种基因型ＡＡ和ＡＢ，ＡＢ型的频率高于
ＡＡ型．未检测到ＢＢ基因型．王文君等［４，５］
对中外１０个猪种生长激素基因ＡｐａⅠ多态位点的检测结果表明，我国地方猪种的ＡＡ基因型频率明显比国外猪种高，等位基因Ａ的频率均大于０．６．这与本实验研究结果有相似之处．但本研究所用的
样本量较少，未检测到ＢＢ基因型是否是样本含量较少所致，还有待于增大样本含量做进一步的研究分析．
［参考文献］
［１］ＶＩＺＥＰＤ，ＷＥＬＬＳＪＲＥ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ
ｔｈｅｐｏｒｃｉｎｅｈｏｒｍｏｎｅｇｅｎｅ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，１９８７，５５：３３９－３４４．［２］ＳＵＫＡＭＯＬＳＲＩＫＷＡＮ，ＫＲＩＳＴＩＮＡＨＵＦＦＯＲＤ，ＬＯＲＩＥ－
ＧＧＥＲＴ，ｅｔａｌ．Ｖａｒｉａｂｌｅｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｇｅｎｏ－ｔｙｐｉｎｇｔｒｅｅｓｈｒｅｗｓ，ｔｕｐａｉａ，ａｎｄｔｈｅｉｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｕｓｅｉｎｇｅ－ｎｅｔｉｃｓｔｕｄｉｅｓｏｆｆｒａｇｍｅｎｔｅｄｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＳｃｉｅｎｃｅＡｓｉａ，２００２，２８：９３－９７．
［３］经荣斌，宋成义，陶勇，等．猪ＧＨ基因部分突变位点对
生产性能的影响［Ｊ］．遗传，２００１，２３（５）：４２７－４６０．．［４］王文君，任军，黄路生，等．中外不同猪品种生长激素
基因遗传多态性检测［Ｊ］．农业生物技术学报，２００３，１１（１）：１０３－１０４．
［５］张依裕，刘若余，刘培琼，等．剑白猪生长激素基因多
态性与部分生产性能的关联分析［Ｊ］．黑龙江畜牧兽医，２００９，７（４）：１０７－１０９．
（２０１２－２９－０５收稿）

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