? RFLP分析
1 导论
生物个体间的差异，本质上是DNA水平上的差异。这是由于进化过程中种种原因引起的基因突变和DNA分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序的改变，当这种改变涉及到限制性酶切位点时，酶切后产生的DNA片段长度将发生变化，限制性片段的长度在不同个体间呈多态性现象，即称为限制性片段长度多态（Restriction Fragment Length Polymorphiems，简称RFLP）。多态即非单态，不一样之意。也就是说，如果两个DNA分子完全相同，用同剂量的同种限制性内切酶在相同的条件下消化，所得的限制性内切酶谱将相同。如果两个DNA分子基本相同，只是在一处或几处发生某种差异，哪怕是很小的差异，消化后两DNA分子的限制性酶谱的条带方式将出现不同，即产生多态性。对这些条带进行分析可从中获得两种DNA分子结构差异的信息。
DNA多态性根据其产生的方式基本上有两种：一是碱基对突变类型，即限制性内切酶识别位点上发生了单个碱基替换（转换或颠换），使原有切点消失或产生新的切点；另一类是结构重排型，这是由DNA内部发生较大的顺序变化所引起的；引起这种变化的原因包括两个方面：一是DNA顺序发生了突变，如缺失、倒位或插入等；二是近年来发现的高变区。高变区由多个串联重复顺序组成，一般位于基因附近。不同个体高变区的串联重复顺序的拷贝数相差悬殊，高变区长度变化很大，从而使高变区两侧限制性内切酶识别位
点的固定位置随高变区而发生相对位移。对于DNA的检测，用限制性内切酶种类越多，对基因结构的了解就越精细。在实际的操作过程中碰到的最大问题就是高等植物的染体太大太复杂了，如果用限制性内切酶降解，很难在琼脂糖凝胶上看到DNA片段的多态性，通常我们看到的都是弥散状的DNA（因为条带太多太密集了）。解决这一问题时人们自然想到了Southern杂交，将琼脂糖凝胶中的DNA转移到硝酸纤维素膜（或其他膜）上，然后再用标记的克隆基因作探针进行杂交，经放射自显影后即可在X光片上看到DNA多态性了。
图2-1
2 试验条件
本方法适用于PCR－RFLP操作，对于需通过Southern杂交来显示RFLP的，可在此基础上，参考Southern杂交技术。
【药品试剂】
10×酶解缓冲液
限制性内切酶
水
10×酶反应终止液：两种反应终止液可供选择。①0.1 mol/L EDTA-Na2，20% FiColl，适量橙G。②0.25%溴酚兰，0.25%二甲苯青FF（或称二甲苯蓝），40%蔗糖水溶液（或用30%甘油水溶液）。
PCR产物（大多数情况下需回收纯化）
【仪器设备】
恒温箱
电泳装置
微量离心机
微量移液器（1～20?l和20～200?l）
0.5ml Eppendorf 管
紫外线观察装置及
照相设备
3 操作程序
将纯化的并经自然干燥的PCR产物（1?g）加17?l TE缓冲液或无菌水（内含RNase A），使DNA完全溶解。在冰上用微量移液器依次加入酶解缓冲液2?l和限制性内切酶3U（1?l）。将清洁、干燥、灭菌的Eppendorf管编号。加样后，小心混匀，置于37℃水浴中（一般情况），酶解2～3h，然后向每个小管中分别加入1/10体积的酶反应终止液，混匀以停止酶解反应。各酶解样品于4℃中贮存备用。
把反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染检测扩增情况。
4 应注意的问题及其解决方法
（1）酶解反应结束后，宜取出2ul用微型电泳检查酶解是否彻底，以决定是否可结束酶解反应。
（2）酶解必须彻底，否则会导致错误的基因分析结论。
5 RFLP分析所表型出的优越性
自从Kan和Dory 1978年首先在?－球蛋白基因中发现第一个DNA多态性位点以来，人们已将注意力从基因表达产物――酶和蛋白质水平的多态性研究转移到分子水平。这是因为RFLP作为遗传标记具有许多优良特点：①从DNA病毒到高等真核生物，RFLP普遍存在。从理论上讲，利用RFLP可以揭示不同基因型间DNA水平上的差异。②能稳定遗传，属核基因组的RFLP具有孟德尔因子的各种遗传特点，属胞质基因组的RFLP一般表现为母性遗传；③共显性：大多数RFLP带型呈共显性，可容易地将杂合体和纯合
体分离开来，引而可以得到更多的遗传信息。④探针与限制酶的组合数量无限，即使异源基因也可以作为探针，探针既可发现功能变异，也可发现内含子和间隔DNA的静变异及侧翼顺序变异。⑤RFLP大多数是由于不编码蛋白质的区域和没有重要调节功能的区域发生了中性突变，对植物体本身通常无害，更不会产生致死效应，对重要经济性状很少有次级效应。⑥RFLP可与基因连锁，在不需测定基因序列的情况下可对相关基因进行分子分析。⑦RFLP不受植物发育时期或器官的影响，能在植株、组织和细胞水平表现、测定。⑧RFLP不受环境影响。⑨取材方便，可以进行重复比较。⑩RFLP无一因多效现象，也无上位效应。
RFLP研究为基因分析提供了一个全新的方法，不仅具有重大的理论意义，而且在基因突变分析、基因定位、基因诊断、个体识别、动植物育种和分类等方面均具有重要的实用价值。
6 RFLP分析在分子生药学中的应用
1．品种及种质资源的鉴定
RFLP标记是中药材品种和种质的DNA“指纹”，具有高度的品种和种质特异性。随着鉴定的RFLP数量的增加，可鉴别出几乎所有的品系和品种，Saller等人估计，只要20～30个RFLP就足以区分所有番茄或玉米自交系。此外，RFLP也可以作为一种方便的手段评价所保存种质的异质性，这是
因为RFLP的异质性是其他性状异质性的指示信号。
2．促进异源种质的转移和利用
dna多态性
原始种和野生种含有大量的遗传变异，它们是品种改良的目标基因的来源。但是，野生种和栽培种杂交困难，且常部分或全部不育，即使获得可育，也难以保证目标性状基因已成功地转移到了栽培品种中，从而限制了野生种的利用。Nilliams等（1990）利用体细胞融合的RFLP标记相结合的方法，开辟了利用RFLP从野生和原始种质中获得有用基因的新领域。
3．研究药用植物的亲缘和进化关系
从本质上说，不同药用植物间的差异是遗传物质的质和量的差异，通过比较亲缘关系较远植物间的RFLP，可以获得进化方面的信息。
4．检测与RFLP标记连锁的主基因
在遗传上与重要农艺性状相连锁的DNA片段在育种上可作为性状基因拷入的各种标记物。例如，把抗病基因转移到感病品种中的传统作法是先进行杂交，然后对后代进行接种鉴定。因此要选育同时能抗几种不同病原的作为品种是困难的或不可能的。应用RFLP标记，根据RFLP标记与目的基因间的紧密连锁关系，使同时筛选多个抗病基因称为可能，而且不需要对体进行接种。
5．构建RFLP标记与数量性状遗传位点（QTL）的连锁图
作物中大多数重要农艺性状均为数量性状，受微效多基因控制，易受环境因素的影响，给分析和利用带来了困难。传统的数量遗传研究方法难以解决诸如控制数量性状的基因数目、数量性状基因座位（Quantitative Trait Loci，简称QTL）在染体上的位置，QTL各基因座位对数量性状的贡献大小及基因间的关系等问题。Euis（1986）在对重组近交系进行RFLP分析后，认为RFLP在数量性状的遗传分析和改良的应用方面有很多问题。但更多的学者认为只要基因组中有足够的RFLP，就可以检测到每种性状的QTL，因此，RFLP可用于QTL的鉴定、评价、绘图和操纵，从而可望推算出控制数量性状的多基因数目，确定QTL在染体上的位置、测定单个基因的作用效应，也许还可应用改良质量性状的方法来改良数量性状。近年来，RFLP标记在水稻、番茄、玉米等植物中的QTL定位研究中取得了可喜的成果。Paterson（1988）等采用区间作图法在番茄整个基因内进行番茄果重（位于1，4，6，7，9，11染体），可溶性固体含量（分别位于4个染体），果实pH值（涉及5个染体）QTL定位研究。

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