MAPK1基因多态性及mRNA表达与缺血性脑卒中神经功能缺损程度的相关分析
陈昭霞;龙建雄;郭晓婧;黄焦;杨佳磊;朱路路;吴旭龙;苏莉
【摘 要】目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)基因rs6928、rs13515、rs1063311多态性及MAPK1基因mRNA表达与缺血性脑卒中(IS)患者神经功能缺损严重程度的相关性.方法 采用Massarray SNP基因分型技术对MAPK1基因的rs6928、rs13515、rs1063311多态性进行基因分型,运用qRT-PCR实验技术测定MAPK1基因mRNA表达水平,使用NIHSS量表对IS患者进行神经功能缺损评分.结果 校正性别、年龄之后,在加性模型、隐性模型中,rs6928多态性与IS患者NIHSS评分具有相关性(P＜0.05).MAPK1基因mRNA表达水平与IS患者NIHSS评分无相关性(P＞0.05).结论 MAPK1基因rs6928多态性可能会影响IS患者神经功能缺损的严重程度.
【期刊名称】《内科》
【年(卷),期】2019(014)002
【总页数】5页(P125-128,141)
【关键词】缺血性脑卒中;MAPK1基因;单核苷酸多态性;mRNA表达;NIHSS评分
【作 者】陈昭霞;龙建雄;郭晓婧;黄焦;杨佳磊;朱路路;吴旭龙;苏莉
【作者单位】广西医科大学公共卫生学院流行病学教研室,南宁市530021;广西医科大学公共卫生学院流行病学教研室,南宁市530021;广西医科大学公共卫生学院流行病学教研室,南宁市530021;广西医科大学公共卫生学院流行病学教研室,南宁市530021;广西医科大学公共卫生学院流行病学教研室,南宁市530021;广西医科大学公共卫生学院流行病学教研室,南宁市530021;广西医科大学公共卫生学院流行病学教研室,南宁市530021;广西医科大学公共卫生学院流行病学教研室,南宁市530021
【正文语种】中 文
【中图分类】R543.5;R743.3
缺血性脑卒中(IS)是一种导致高伤残和高死亡的严重的神经系统疾病，是脑卒中最主要的类型，占全部脑卒中的80%以上[1]。《美国国立卫生研究院卒中量表》(NIHSS)是脑卒中神经功能缺损的定量测量工具，能够反映脑卒中患者神经功能缺损的严重程度[2]。丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)是 MAPK 信号通路中的关键激酶。MAPK1在突触可塑性、神经活动和连接
中起着关键作用[3]。此外，MAPK1能通过激活MAPK级联反应在缺血神经元和完整脑细胞的凋亡中发挥重要作用[4]。 这些研究提示，MAPK1基因可能在IS的发生和进展中起一定的作用。目前已有一些研究对基因多态性及mRNA表达与NIHSS评分的相关性进行了探讨[5-6]，然而有关MAPK1基因多态性及MAPK1基因mRNA表达与NIHSS评分相关性的研究尚未见有报道。本研究探讨了IS患者MAPK1基因 rs6928、rs13515和rs1063311多态性及MAPK1基因 mRNA表达与NIHSS评分的相关性，旨为探讨IS神经功能缺损的分子学机制提供参考。
1 对象与方法多态性与虚函数
1.1 研究对象 选择2016年9月至2017年6月在广西中医药大学第一附属医院神经内科住院的缺血性脑卒中患者为研究对象。纳入标准：患者诊断符合1995年中华医学会第四次全国脑血管病学术会议修订的《各类脑血管疾病诊断要点》，行头颅CT和/或MRI检查，由两名主治及以上职称的神经内科医师确诊为缺血性脑卒中。排除因脑血管畸形、脑外伤、动脉炎、血液病、药物和肿瘤等引起的脑卒中以及脑梗死昏迷、短暂性脑缺血发作、脑梗死性失语症和出血性脑卒中患者，排除合并严重肝肾功能不全、造血功能障碍和重度休克患者。本研究共纳入45例IS患者，其中男28例，女17例，年龄(67.44±9.40)岁；均为汉族人且相互之
间均无血缘关系。本研究已获广西中医药大学医学伦理委员会审查批准，纳入研究患者均签署知情同意书。
1.2 神经功能缺损程度评价 由经统一培训的神经内科住院医师采用NIHSS量表在IS患者入院时对其进行神经功能缺损程度评估。NIHSS量表的分值为 0～42分，分数越高表示患者神经功能缺损程度越严重。根据NIHSS评分将45例IS患者分为3组：轻度神经功能缺损组32例(≤4分)、中度神经功能缺损组10例(5～15分)、重度神经功能缺损组3例(≥16分)。
1.3 基因分型 使用乙二胺四乙酸抗凝管采集患者清晨空腹外周静脉血2 mL，采用全血基因组DNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)严格按照产品说明书所述操作步骤从血液样品中提取基因组DNA。使用NanoDrop 2000仪器检测OD值以确定DNA浓度，通过琼脂糖凝胶电泳评估DNA的完整性。将质检合格的DNA样本保存在-80℃冰箱备用。由博淼生物科技(北京)有限公司采用Assay Designer 3.1软件进行rs6928、rs13515和rs1063311多态性的引物设计及合成，并采用Massarray SNP基因分型实验技术，在Agena平台上进行三个基因多态性的基因分型。引物序列如下：
1.4 基因表达水平检测 使用乙二胺四乙酸抗凝管采集患者清晨空腹外周静脉血5mL，采用TR
Izol试剂(美国 Invitrogen 公司)严格按照试剂操作步骤从血液中提取总RNA。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒(大连TaKaRa公司)进行逆转录合成cDNA实验。使用SYBR® Premix Ex TaqTM II试剂盒(大连TaKaRa公司)，在Applied Biosystems 7500 Fast型荧光定量PCR仪上严格按照实验操作规程进行qRT-PCR实验，测定 MAPK1 基因的 mRNA表达水平。引物设计及合成由宝生物工程(大连)有限公司完成。MAPK1基因的引物序列如下：上游引物为5′-CGTTGGTACAGGGCTCCAGAA-3′，下游引物为5′-CTGCCAGAATGCAGCCTACAGA-3′。作为内参的管家基因甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的引物如下：上游引物为5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′，下游引物为5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′。qRT-PCR反应条件如下：95℃ 30s预变性；95℃ 5s变性；60℃ 34s退火、延伸40个循环。采用2-△ct法计算 MAPK1基因mRNA的相对表达水平。
1.5 统计学处理 使用PLINK软件，采用一般线性模型进行MAPK1基因多态性与缺血性脑卒中患者NIHSS评分的关联分析。使用SPSS 16.0统计软件，对计数资料的相关性进行Spearman相关分析；对计量资料的相关性进行Pearson相关分析；非正态分布的计量资料组间比较采用非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 不同MAPK1基因型缺血性脑卒中患者的NIHSS评分比较 秩和检验结果显示，携带MAPK1基因rs6928不同基因型的缺血性脑卒中患者的NIHSS评分比较，差异有统计学意义[(GG+GC)vs. CC：P=0.010；GC vs.(GC+CC)：P=0.009；G vs. C：P=0.002]；携带MAPK1基因rs1063311不同基因型的缺血性脑卒中患者的NIHSS评分比较，差异亦有统计学意义[(TT + TC)vs. CC：P=0.040]。见表1。
表1 不同基因型缺血性脑卒中患者的NIHSS评分比较位点模型基因型n中位数(四分位数间距)u Prs6928显性模型GG+GC322(1-4)-2.5750.010CC135(3-6.5)隐性模型GG71(0-2)-2.6210.009GC+CC384(2-6)等位基因模型G392(1-4)-3.0380.002C514(2-6)rs13515显性模型TT+TC152(1-6)-0.1340.178CC304(2-5)隐性模型TT10(0-0)-1.2420.130TC+CC443(1-5)等位基因模型T161.5(0.25-5.25)-1.5960.110C743(1.75-5)rs1063311显性模型TT+TC212(1-4)-2.0490.040CC234(2-7)隐性模型TT11(1-1)-1.0720.284TC+CC433(2-5)等位基因模型T222(1-4)-1.9440.052C663.5(2-6)
2.2 MAPK1基因多态性与缺血性脑卒中患者神经功能缺损程度的相关分析 Spearman相关分
析结果显示，MAPK1基因rs6928、rs1063311多态性基因型与缺血性脑卒中患者的NIHSS评分显著相关(P=0.001；P=0.031)，而rs13515与缺血性脑卒中患者 NIHSS 评分无相关性(P=0.144)。见表2。一般线性模型分析结果显示，校正性别、年龄之后，在加性模型(P=0.045)、隐性模型(P=0.017)中，rs6928多态性基因型与缺血性脑卒中患者 NIHSS评分具有相关性(P<0.05)。见表3。
表2MAPK1基因多态性与缺血性脑卒中患者NIHSS评分的相关分析位点rPrs69280.4850.001rs135150.2210.144rs10633110.3250.031
表3MAPK1基因多态性与缺血性脑卒中患者NIHSS评分的关联分析位点加性模型βa (95% CI)Pβb (95% CI)Padj显性模型βa (95% CI)Pβb (95% CI)Padjrs6928-2.33(-4.75-0.09)0.066-2.61(-5.09～-0.13)0.045-2.28(-5.84-1.29)0.217-2.17(-5.87-1.52)0.256rs13515-0.29(-3.43-2.86)0.859-0.60(-3.91-2.71)0.7250.10(-3.39-3.59)0.956-0.18(-3.82-3.47)0.925rs1063311-3.00(-5.94～-0.06)0.052-3.05(-6.03～-0.06)0.052-3.22(-6.42～-0.02)0.055-3.20(-6.46-0.07)0.063
续表3位点隐性模型βa (95% CI)Pβb (95% CI)Padjrs6928-4.02(-8.39-0.36)0.079-6.04(-10.8
0--1.28)0.017rs13515-4.64(-15.71-6.44)0.416-5.48(-16.91-5.95)0.353rs1063311-3.72(-14.87-7.43)0.517-5.22(-16.90-6.46)0.387

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