植物基因功能研究的主要方法
随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信
号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）
超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。重要逆境调控基因微小的表达变化就可以引起下游基因的积累效应，有可能使生物体表型发生可评估的变化，使其功能凸现。超量表达的技术规范已经相当成熟，与RNAi相比，目的基因超量表达后的表达量更易检测，但其与反义抑制和共抑制一样，均会导致转基因植株的致死效应或强烈的多重效应。
目前所常用的超量表达载体可以分成组成型和诱导型两种。基因诱导表达可以实现基因表达的空间控制、时间控制和数量控制，从而避免了组成型超量表达带来的麻烦。在非诱导条件下，诱导表达载体所转化的基因不表达或表达产物没有活性，不会干扰植物的正常发育，也不会导致多重效应。一旦诱导，基因迅速表达或基因产物被激活，并在一定时间内保持稳定。在植物体内，诱导信号易于察觉，接受。通过此方法，已成功研究了一系列植物基因的功能，如将逆境应答信号途径中的基因转化植物，不仅可以通过表型差异鉴定基因功能，还可以提高植物的抗逆性，用于遗传改良。
2. RNA干扰（RNAi）
RNA干扰现象的机制是生物学研究的热点之一，其技术也被用于高通量地研究基因功能。Fire 等证实dsRNA在体内RNase作用下将dsRNA降解成21－25 nt的片段，这些小片段与内源mRNA 结合后，可由RNase高效降解，表现出基因敲除的特性，且可传递给子代，这一现象叫RNA interference(Fire et al., 1998)。在细胞内同时表达同一基因序列sense RNA和antisense RNA所形成的双链RNA，dsRNA进入组织或细胞诱导内源序列特异的RNA降解的机制，从而高效抑制目标基因的表达(Chuang and Meyerowitz, 2000)[3][4][5]。RNA沉默的现象已被证
明广泛的存在于各种生物体中，在动物里，被称为RNAi（RNA interference）；在真菌中，被称为quelling；而在植物里，则被称作为PTGS（post-transcriptional gene silencing）(Voinnet, 2002)。RNA干扰可以达到破坏目标基因表达而不干扰其它基因表达的目的。但是，一些低水平表达基因的RNAi现象并不明显(Tabara et al., 1998)，并且RNAi容易抑制植物中家族成员之间同源性非常高的整个家族，这样就无法从转基因植株的表型来分析目标基因的功能。另外，设计RNAi载体时，如何有效控制RNAi的抑制效率和程度还有待研究和实践。目前在植物中用于RNAi的载体有很多，最早有pMCG161(Waterhouse et al., 1998)，pKANNIBLE(Wang and Waterhouse, 2002)，pHANNIBAL等，但利用它们构建载体时，需要进行多次酶切连接及转化，需研究的基因数量较多时，用上述RNAi载体构建将是很繁琐的任务。Wesley等构建了一个高效的载体——pHELLSGATE，此载体既具有高效抑制的
特性，又引入了Gateway重组克隆系统(Wesley et al., 2001)。重组系统采用噬菌体的融源裂解过程，重组位点attB与attP，attL与attR特异识别反应。对大肠杆菌DH5α和DH10B具有致死效应的ccdB基因应用于重组位点间（attP1-ccdB-attP2和attP2-ccdB-attP1），质粒只能在大肠杆菌突变体菌株DB3.1中生长，因而重组反应后的产物（致死基因已置换）打入DH5α或DH10B，长出的克隆即阳性克隆。此载体具快速、高效的特点，为大量构建RNAi抑制载体提供了一个有力的工具。
3. 插入突变
插入突变是通过使目的基因失活从而直接研究基因功能的方法，可分为转座子插入突变和T-DNA插入突变。插入突变具效率高、基因失活完全、容易分离鉴定被插入引起失活的目的基因等优点。但因为植物中有一定数量的多拷贝基因，有的甚至紧密串联，使得到目标基因的纯合突变体受到局限，基因家族的存在也影响得到表型差异明显的突变体。现在拟南芥，玉米，矮牵牛已有大量可用的突变体体，水稻的插入突变体体也在逐渐扩充完善。插入突变方法已成功应用于分离鉴定拟南芥转录因子MYB基因家族的突变体(Meissner et al., 1999)。
T-DNA插入突变能直接在基因组DNA中产生稳定的插入突变，不需要额外的步骤来稳定T-DNA 插入序列，虽然T-DNA上一页[3][4][5]标签偏好插入基因密度高的染体区以及基因的5’和3’调控区，但并不影响用T-DNA插入突变位点来饱和基因组。此方法也存在一定缺点，其只适合易被T-DNA转化的植物且T-
多态性的作用
DNA边界的质粒序列可随着T-DNA整合到基因组DNA中，同时常常出现由T-DNA整合引起的各种染体重排现象，以致突变表型与T-DNA插入无关。转座子进行插入突变的优点有：转座子能造成突变体反转，故可进一步确证表型是否由转座子插入突变引起；由于大多数转座的元件靠近目的基因，即使在突变体系中没有发现期望的插入位点，也仍可以采用转座子在连锁位点上的转座获得目的基因被插入失活的品系；当一个基因家族的多个成员沿染体串连排列时，可采用复制型的转座系统创建该基因家族全部成员均被敲除的突变体。
4. 基因的定点诱变（site-directed mutagenesis, SDM）
使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，它是基因工程和蛋白质工程的重要手段，已经广泛应用于基因表达调控、基因结构与功能以及蛋白质性质等诸多研究领域。基因诱变包括用M13 DNA进行的寡核苷酸介导诱变、寡核苷酸介导的PCR诱变、改进型双引物诱变、简并寡核苷酸引物、随机诱变等。Kozaki等通过定点诱变的方法对玉米ID1锌指蛋白的ID结构域进行了研究(Kozaki et al., 2004)。利用定点诱变方法研究拟南芥的MADS结构域调控因子AGL15，分析出对基因表达极为重要的结构区域(Zhu and Perry, 2005)。
5. 微阵列（microarray）
微阵列（microarray）技术为鉴定基因的功能提供了一种高通量的方法，其可在一个实验中
提供成千上万个基因的表达模式信息。微阵列包括cDNA微阵列(cDNA microarray)上一页[3][4][5]和DNA芯片(DNA chips)。早在上世纪90年代，就有研究者将短的DNA片断固定到支持物上，借助杂交方式进行序列测定(Bains, 1998a; Bains, 1998b)。基因芯片从其基本原理是：将成千上万条DNA片段（cDNA、EST或特异寡核苷酸片段）按点阵方式点样在固相支持物上，固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时，称为微阵列，把固相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时就称为DNA芯片。检测时，首先以来自不同生理状态和发育阶段的mRNA 为模板，以放射性同位素或荧光物标记的dNTP为底物反转录合成cDNA，再用合成出的cDNA 与微阵列或DNA芯片杂交，然后通过计算机对结果进行判读和处理，进行杂交结果的成像和数据分析。
随着此技术的不断完善和生命科学的发展，微阵列技术在植物生物学上的应用也取得了长足的进步，并已应用于植物DNA测序、植物病理学、毒理学研究、检测基因突变和多态性位点、植物与害虫直接的相互作用、转基因植物研究等研究领域。而其在水稻逆境胁迫抗逆性研究中的应用显示在：基因差异表达研究和寻目标基因。微阵列技术为同时分析一个生物体所包含的所有基因的差异表达提供了一个相当简单的方法，可以利用此技术把水稻不同品种之间，或者水稻在不同生长发育阶段、不同生理状态下的基因表达情况进行差异表达分析。通过对结果的分析与处理，我们就能寻、发现和定位决定重要性状(如高产、抗虫、抗病、耐寒和耐旱等)的基因。Thimm等使用一个至少代表6000个基因序列的微阵列，分析了拟南芥根部和枝条部分因缺铁而发生的基因表达的改变(Thimm et al., 2001)。另外，研究人员还使用微阵列技术，对拟南芥根部在缺氧条件下培养时的基因表达进行了研究(Klok et al., 2002)。
目前，拟南芥和水稻大规模的EST数据库已经建立，各种作物（包括棉花，玉米，大豆，土豆和高粱等）大规模测序工作也已在进行之中。对盐胁迫诱导的、具有组织特异性和发育阶段特异性的拟南芥和水稻cDNA文库也开展了大规模的EST测序。最新的EST数据库可在逆境功能基因组协会(Stress Functional Genomics Consortium)的网站(/)浏览搜索。至少有两个公众资助的项目提供世界范围的微阵列服务：美国的AFGC(Arabidopsis Functional Genomics Consortium, AFGC)项目和英国的GARNet’s项目。前者进行了拟南芥不同组织(包括根、叶、角果、花和茎)，不同发育阶段（从种子萌发到种子成熟），不同基因型的基因表达谱分析，该项目对外服务接受来自世界各地研究者的上一页[3][4][5]RNA样品完成微阵列分析（包括标记、杂交和数据收集），全部实验数据存放于斯坦福微阵列数据库。
6. 酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）
酵母双杂合系统是在1989年由Stanley Fields和Ok-kyu Song等在研究真核基因转录调控中提出并初步建立的，其理论基础是转录因子的结构模型，即当转录因子的DNA-结合结构域与激活结构域紧密结合以后，将导致一系列基因转录的增加(Fields and Song, 1989)。自问世以来，该技术已成为研究蛋白相互作用、蛋白结构与功能的重要手段，已广泛应用于研究蛋白—蛋白间的相互作用、蛋白与其它分子相互作用、筛选未知蛋白、研究蛋白的功能等领域。酵母双杂交系统利用转录因子GAL4的DNA-结合结构域（DNA-binding domain）GAL4-BD 与激活结构域（transcription-activating domain）GAL4-AD的特异
载体，将许多开放阅读框架(ORFs)分别连在这两种载体上，构成文库，然后转入酵母细胞，并与酵母细胞克隆杂交。二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能，而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。当文库中两个ORF编码的蛋白质在酵母细胞中表达，并发生相互作用时，就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起，分离的AD与BD在空间上得以接近，从而与上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)结合，激活相应报告基因(report gene) 转录。通过培养基营养缺陷筛选法，可将没发生相互作用的酵母克隆筛选掉，而将发生相互作用的
酵母克隆保留下来。然后对发生相互作用的蛋白质进行分析，通过测序就可以鉴定ORF。
酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因，亦可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域，对大规模筛选分析蛋白质间的相互作用来说是一项简便易行的方法。但这种研究工作仅仅是潜在的蛋白质间的相互作用，结果还需要进一步的生物学实验验证或者排除。同时，双杂交系统还存在其它局限性：许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行；假阳性的使蛋白质互作的鉴定增加困难。许多研究者采用假阳性显示分析法和双筛选系统等方法对双杂交系统进行了改进和发展。对酵母双杂交系统进行的称为“反向”双杂交的改进可被用来鉴定破坏蛋白质间相互作用的复合物和肽链。

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