摘要】  目的 比较耐顺铂的人肺腺癌细胞(A549DDP)凋亡相关基因的表达与亲代A549细胞的差异，探讨细胞凋亡与细胞耐药的发生机制。方法 应用Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片，检测A549和A549DDP细胞相关凋亡基因表达水平。结果 A549DDP细胞表达BAD、BAG3、BFAR、CARD8、CASP6、GADD45、TNFRSF14、CD70、TRADD、TRAF1、TRAF3基因较亲代A549细胞显著增高(P<0.05),二者比值上调2倍以上。结论 肺腺癌A549DDP细胞过表达上述凋亡相关基因，可能是导致细胞凋亡受抑、细胞耐药的主要原因。
【关键词】  肺癌;凋亡基因;细胞凋亡;耐药
细胞耐药是导致化疗失败的主要原因。研究发现耐药的发生与细胞凋亡基因的异常表达密切相关。采用Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片方法检测细胞凋亡相关基因，具有敏感性高、速度快和重复性好等优点。目前尚未见以Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片方法检测A549细胞凋亡相关基因的报道。本文采用Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片检测人肺腺癌亲代细胞与耐顺铂细胞(A549和A549DDP)凋亡相关基因,并对检测结果的临床意义进行初步分析，进一步探讨肿瘤细胞凋亡与耐药的发生机制。
  1 对象与方法
  1.1 对象 人肺腺癌亲代A549细胞和耐顺铂的A549DDP细胞(华西医科大学新桥医院呼吸病研究所提供)。
  1.2 方法
  1.2.1 细胞培养 人肺腺癌A549与A549DDP细胞,以含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5% CO2条件下培养,每2～3 d传代1次,初始密度为2×105/ml(2 ml/6孔板)。取对数生长期细胞进行实验。
  1.2.2 凋亡基因检测 按着Oligo GEArray基因芯片实验操作步骤进行(Oligo GEArray细胞凋亡基因芯片由上海康成生物科技有限公司提供)。
  1.2.3 RNA 抽提 Trizol一步法进行细胞总RNA的抽提。
  1.2.4 RNA质量检测 经变性琼脂糖凝胶电泳及紫外吸收测定法对RNA质量进行检测。
  1.2.5 cRNA标记与合成 首先合成cDNA，再合成cRNA，并对合成的cRNA进行标记和扩增，进而cRNA 纯化。
  1.2.6 芯片杂交、化学发光检测、图象采集和数据分析。
  1.3 统计学分析 采用χ2检验。多态性的作用
  2 结 果
  对芯片中114个与凋亡相关的基因检测时发现耐顺铂的A549DDP细胞表达凋亡相关基因Bcl 2凋亡调节基因家族(BAD、BAG3)、caspase家族(CASP6、CARD8)、肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF1、TRAF3、 CD70)、肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF14、BFAR)及与肿瘤坏死因子受体超家族成员TNFRSF关联的死亡结合域(TRADD、GADD45)较亲代A549细胞显著增高(P<0.05)，二者比值上调2倍以上(表1)。表1 A549与A549DDP细胞凋亡相关基因表达水平上调2倍以上基因
  3 讨 论
  肿瘤的发生与发展是细胞增殖和凋亡平衡失调的结果。凋亡是一种程序性细胞死亡,许多信号通道介导细胞凋亡过程，凋亡相关基因表达异常与细胞凋亡受抑及细胞耐药密切相关。而耐药性又是影响肿瘤化疗效果的重要因素,化疗失败的主要原因之一就是细胞耐药。此时,药
物能如期进入细胞内并损害细胞,但因与凋亡相关的基因过度表达或表达下调而致凋亡受到抑制,此种损害被转换为无效信号。本组耐顺铂的A549DDP细胞表达BAD、BAG3、BFAR、CARD8、CASP6、GADD45、TNFRSF14、CD70、TRADD、TRAF1、TRAF3基因较亲代A549细胞显著增高，二者比值上调2倍以上，表明上述凋亡基因的过表达参与A549细胞耐药。BAD、BAG3均属Bcl 2凋亡调节基因家族成员，位于细胞质内线粒体外膜，通过存在于细胞内的可变蛋白(折叠或伸展结合)和抑制Ga2+跨膜运动，增强肿瘤细胞抗氧化性能，参与细胞的抗凋亡作用，进而增加细胞对化疗药物的抵抗性〔1〕。
  肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)是一类新近发现的细胞内信号传导的衔接蛋白。迄今为止，已发现6种不同的TRAF (TRAF1、 TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6)。作为一种衔接蛋白，TRAFs与一些细胞表面受体直接作用，介导下游信号级联反应，调节细胞生存或死亡平衡。在6种TRAFs分子中，TRAF1、TRAF3、 TRAF5在细胞的凋亡过程中起着重要的作用。 TRAF1表达相当局限，仅存在脾、肺及睾丸中，因此，TRAF1是TRAFs分子中最有可能出现差异表达的分子之一。新近研究证实TRAF1是一种抗凋亡蛋白，TRAF1过表达抑制caspase 8活化,进而抑制肺癌细胞凋亡〔2，3〕;TRAF3、TRAF5通过活化信号转导，活化泛素蛋白连接酶参与细胞凋亡调节。本研究显示A549DDP细胞表达TRAF1、TRAF
3基因水平明显高于亲代A549细胞，提示TRAF1、TRAF3参与肺腺癌细胞凋亡抑制，导致细胞耐药。
  肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)有许多成员，涉及到促凋亡及抗凋亡两种截然不同的信号传导途径，究竟TNFRSF活化后细胞是生存还是死亡则取决于双方信号水平的强弱对比及作用时机的不同。在生理状态下，TNFR1其信号途径是TNF依赖型的，非配体依赖的TNFR1信号凋亡通路被阻断，行使这种负调作用的蛋白是死亡结构域沉默蛋白(silencer of death domains，SODD)。在非配体存在的情况下，SODD与TNFR1胞浆段的死亡结构域预先结合，形成SODD TNFR1复合体，该复合体不能与含有死亡结构域的TNFR1结合蛋白(TNFR1 associated death domain protein，TRADD)等相互作用，TNFR1信号通路处于失活状态。给予TNF刺激后，SODD从复合体中脱落，TNFR1信号通路被打开〔4〕。首先，TRADD与TNFR1通过死亡结构域之间的作用相互结合，然后TRADD作为一个衔接平台，进一步募集其他信号分子至激活受体，从而决定细胞生存与死亡。受体作用蛋白(receptor interacting protein，RIP)通过死亡结构域与TRADD结合,可进一步激活TNFR相关因子2(TNFR associated factor 2，TRAF2)，活化的TRAF2再激活2个独立的信号传导途径：(1)可通过磷酸化作用激活NF κB诱导激酶，继而活化κB激酶复合物抑制蛋白，导致其降解从而失去对NF
κB的抑制，NF κB转位至细胞核激活多种基因的转录，主要包括抗凋亡基因如细胞凋亡抑制蛋白基因 1、2，B细胞淋巴瘤 2基因,生长抑制和DNA损伤诱导基因45的转录，通过抑制caspase 8的活化等途径发挥抗凋亡作用。(2)TRAF2还可与凋亡信号调节激酶,转化生长因子 β活化激酶,促分裂原激活的相关蛋白激酶等分子相互作用并最终激活c Jun氨基端激酶(c Jun NH2 terminal kinase，JNK)，通过JNK/SAPK途径抗凋亡〔5，6〕。肿瘤坏死因子受体超家族14(TNFRSF14)，通过细胞表面受体信号连接转导途径，活化caspase抑制剂，抑制活化的caspase，释放螯合的细胞质中的NF k颗粒，参与细胞凋亡。
  caspase家族是一组与细胞凋亡有关的蛋白酶，包括很多成员,本实验中涉及的CARD6、CARD8、CASP6均属caspase家族。化疗药物引起的细胞凋亡均须激活caspase。caspase蛋白酶在死亡受体介导的细胞凋亡中起着中心的作用。其中caspase 8(CARD8)是这一凋亡过程中首先被活化的ICE家族蛋白酶。由于caspase 8具有FADD样DED结构域，并且能够通过DED结构域与FADD结合，所以caspase 8可以在凋亡过程中间接与细胞膜受体发生联系，从而将细胞膜事件转化为细胞浆事件。caspase 8活化后，一方面它可以剪切活化caspase 3、caspase 7、caspase 4、caspase 9和caspase 10，通过这些蛋白酶剪切底物使凋亡得以进行;另一方面，它的活性可以被CrmA所抑制，籍此可作为细胞凋亡负调控因素作用的环节。
caspase 6具有活化水解酶、水解蛋白和分解肽作用，可以降解层蛋白B参与细胞的凋亡活动。本组实验研究显示A549DDP细胞表达CARD8、CASP6水平较亲代A549细胞增高明显，提示上述caspase家族成员参与肺腺癌A549细胞耐药的发生。
  CD70分子(CD70)具有结合肿瘤坏死因子的作用，参与细胞间的信号转导，影响细胞凋亡; BFAR 具有双向调节细胞凋亡的功能因子，能够活化泛素蛋白连接酶，进而活化泛素蛋白，具有抗凋亡作用;TRADD，与TNFRSF1A 关联的死亡结合域，活化信号转导，正调节Ⅰ κ(粒)B激酶/NF κ(粒)B级联反应，参与细胞凋亡;本研究显示A549DDP细胞表达BFAR、GADD45、CD70、TRADD水平均较亲代A549细胞高，二者比值超过2倍以上，提示上述基因参与肺腺癌A549细胞凋亡抑制。
  本文在对A549DDP与亲代A549细胞凋亡相关基因的表达研究中发现部分基因在细胞耐顺铂后表达明显上调，说明这些基因参与肺腺癌细胞的凋亡抑制和细胞耐药的发生;但也发现部分基因表达下调,是否参与细胞耐药并如何参与还不十分清楚，有待进一步探讨。
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