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中国骨质疏松杂志 2021 年 2 月第 27 卷第 2 期 Chin J Osteoporos, February 2021,Vol 27, No. 2
Published online www.wanfangdata doi ：10. 3969/j.issn.l006-7108. 2021. 02. 020-药物研究-
杜仲腰痛丸调控p53对老年骨质疏松症患者骨密度、 骨代谢及骨形成影响的作用机制
朱换平1石敏2张维平1马同1赵继荣"
1. 甘肃省中医院，甘肃兰州730050
2. 兰州市城关区妇幼保健院，甘肃兰州730030
中图分类号：R451； R336 文献标识码：A 文章编号：1006-7108(2021) 02-0257-06
摘要：目的 探讨杜仲腰痛丸调控p53对老年骨质疏松症(osteoporosis,OP)患者骨密度(bone mineral density, BMD)、骨代谢 及骨形成影响的作用机制。方法 选取自2018年3月至2019年8月期间，在甘肃省中医院门诊就诊的老年骨质疏松症患者 30例，口服碳酸钙D3咀嚼片(钙尔奇D) +骨化三醇胶丸(罗钙全)+杜仲腰痛丸(eucommia lumbago pill ,ELP )6个月；并
选取同期于本院体检健康者30名为对照组。分别用0.2、0.4、0.8 mg/mL ELP 培养液处理p53基因过表达的成骨细胞
MC3T3-E1o 通过RT-PCR 及Western blot 检测p53、ALP 、OCN 及Runx 2 mRNA 与蛋白的表达水平；进行骨密度及骨代谢生化
指标检测并分析与p53表达的相关性。结果 与对照组相比,OP 患者的P53 mRNA 与蛋白的表达量及BGP 、TRAP 、DPD/CR 显著增加，各部位BMD 显著降低；ELP 6个月后,p53的mRNA 与蛋白的水平及BGP 、TRAP 、DPD/CR 均明显降低，而
L 2~4BMD 显著升高。相关性分析表明,p53的表达水平与L 2~4BMD 含量呈显著负相关，而与BGP 、BALP 及DPD/CR 含量呈显
著正相关。与对照组相比，不同浓度的ELP 明显降低MC3T3-E1中p53的表达水平；同时0. 4 mg/mL 的ELP 可以逆转p53过
表达的影响及对ALP 、OCN 和Runx 2的表达。结论 杜仲腰痛丸可能通过抑制p53的表达影响老年骨质疏松症患者的骨密 度、骨代谢，促进骨形成。
关键词：杜仲腰痛丸；老年骨质疏松;p53；骨形成
The mechanism of Eucommia Lumbago Pill in regulating the effect of p 53 on bone mineral density ， bone metabolism and bone formation in elderly patients with osteoporosis
ZHU Huanping 1 , SHI Min 2, ZHANG Weiping 1 , MA Tong 1, ZHAO Jirong 1 *
基金项目：2019年甘肃省中医药科研课题(GZK-2019-2)
* 通信作者：赵继荣，Email ：*****************
1. Gansu Province Hospital of TCM , Lanzhou 730050, China
2. Lanzhou ChengGuan Maternity and Child Care , Lanzhou 730030, China
* Corresponding author : ZHAO Jirong ，Email :3469852522@ qq
Abstract : Objective To explore the mechanism of Eucommia Lumbago Pill 's regulation of p 53 on bone mineral density , bone
metabolism and bone formation in elderly patients with osteoporosis ( OP ). Methods From March 2018 to August 2019, 30
elderly patients with osteoporosis ( OP ) who were treated in the outpatient clinic of Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine were treated with calcium Erqi ， Luoquanquan + oral Eucommia Lumbago Pills ( ELP ) treated for 6 months ， and selected 30 healthy people who were examined in our hospital during the same period as the control group. Osteoblasts MC 3T 3-E 1 with p 53
gene overexpression were treated with 0. 2, 0. 4, and 0. 8 mg/mL ELP medium. RT-PCR and Western blot were used to detect the
expression levels of p 53, ALP , OCN and Runx 2 mRNA and protein ； bone mineral density and bone metabolic biochemical
indicators were detected and the correlation with p 53 expression was analyzed. Results Compared with the control group , the expression levels of P 53 mRNA and protein and BGP , TRAP , DPD/CR in serum samples of OP patients were significantly
increased , while BMD in each was significantly reduced. ELP treatment for 6 months After that , the levels of p 53 mRNA and
protein and BGP , TRAP , DPD/CR were significantly reduced , while L 2_4BMD was significantly increased. Correlation analysis showed that the expression level of p 53 was significantly negatively correlated with the content of L 2_4 BMD , but significantly
positively correlated with the content of BGP,BALP and DPD/CR.Compared with the Control group,different concentrations of ELP significantly reduced the expression level of p53in MC3T3-E1.Meanwhile,0.4mg/mL ELP reversed the effect of p53 overexpression and the expression of ALP,OCN and Runx2.Conclusion Eucommia Lumbago Pill may affect the bone mineral density,bone metabolism balance and promote bone formation in elderly osteoporosis patients by inhibiting the expression of p53. Key words:Eucommia Lumbago Pilll；osteoporosis in the elderly；p53；bone formation
人类骨代谢平衡通过骨吸收和新骨形成的耦合来维持［1］°当破坏骨形成和骨吸收之间的平衡时，骨质疏松症就会发生［2］°骨质疏松症是最常见的与年龄相关的慢性疾病之一，随着年龄的增长，骨转换率逐渐下降，导致骨密度（bone mineral density, BMD）和骨矿物质含量（bone mineral content,BMC）逐渐下降［3］°骨质疏松症的发病机理尚未完全阐明。有研究［4］表明，骨质疏松症是一种多因素疾病，多种基因和信号通路参与其发病机理［5］°p53蛋白由TP53基因编码，Jia等［6］证明TP53多态性可能导致骨质疏松症的风险°Tao Yu等［7］同样研究发现,p53在骨质疏松症的发生中发挥关键作用，抑
制p53的某些活性可能抑制骨质疏松症的发生和（或）进展。另外,Xie等［8］也发现TP53在原发性骨质疏松症中起关键作用。杜仲腰痛丸（eucommia lumbago pill,ELP）被证明对骨质疏松症具有作用⑼°但ELP是否通过调控p53影响老年骨质疏松症患者的骨密度、骨代谢，尚无相关报道。本研究将通过ELP对临床患者p53的表达水平的影响及其与骨密度、骨代谢指标的相关性进行分析，同时通过体外细胞实验验证ELP是否通过抑制p53的表达，促进骨形成°
1材料与方法
1.1材料
1.1.1一般资料：选取自2018年3月至2019年8月期间，在甘肃省中医院门诊就诊的老年骨质疏松症患者30例。所有患者均符合WHO对老年骨质疏松症的诊断标准。其中男性12例、女性18例，年龄65~70岁，平均（70.15±
2.73）岁。选取同期于本院体检健康的老年男性10名、女性20名为对照组，年龄65~70岁，平均（70.85±
3.26）岁。以上两组均自愿加入该临床实验，且均签订知情同意书。排除患有其他骨科疾病、精神疾病及血液病患者，患有严重心肝肾功能损伤患者，对本研究使用药物过敏的患者°将受试者分为对照组（未患骨质疏松症者30例）、0P组（患骨质疏松症者30例）、ELP组（接受杜仲腰痛丸患者30例）°
1.1.2细胞株：小鼠成骨细胞MC3T3-E1购于中国科学院细胞库，培养于含有15%胎牛血清的DMEM 培养基中，在37T、5%CO2条件下培养。
1.2方法
1. 2.1药物：给予ELP组患者碳酸钙D3咀嚼片（钙尔奇D,600mg/d,1次/d）、骨化三醇胶丸（罗钙全,0.25Rg/次,2次/d）+口服杜仲腰痛丸（ELP, 8粒/次,3次/d，由甘肃省中医院制剂中心提供），后6个月进行疗效评价。
1. 2.2p53过表达载体构建及转染MC3T3-E：根据Gen-Bank中人p53基因序列，选择kana抗性的p53基因过表达载体plRES2-EGFP-p53WT进行阳性克隆、转染MC3T3-E1细胞（由广州辉骏生物科技股份有限公司完成）°
1.2.3ELP培养液配制及细胞分组：取ELP20g （甘肃省中医院制剂室生产）浸泡24h，旺火煮沸30 min，取药液2次，混合2次药液，浓缩至20mL左右。按2:3比例加入无水乙醇，静置24h°4000 r/min分别离心55、11min，取上清液，水浴浓缩蒸发干液体，加蒸馏水配制成2、4、8g/mL ELP原药。均用高温消毒30min,4冰柜冷藏。取3份20mL 的DMEM培养液，分别加入2、4、8g/mL杜仲原药4 r L，即得含0.2,0.4和0.8mg/mL ELP培养液（pH 7.2~7.4，渗透压280~320mOSM/L）°将细胞分为对照组（无任何处理）、ELP（0.2、0.4、0.8mg/mL）组、p53过表达组、ELP+p53过表达组（0.4mg/mL ELP+p53过
表达）°
1.2.4RT-PCR检测：根据北京百奥公司的组织细胞提取试剂盒说明书进行RNA提取操作。参照Thermo Scientific反转录说明书，合成cDNA°并以双标准曲线的相对定量法进行qPCR定量分析，使用2-AAct法测定p53、ALP、OCN及Runx2mRNA的相对表达水平,GAPDH为内参°实验设置3个平行复孔，结果取平均值。引物如表1所示。
表1实验中使用的引物
Table1Primers used in the experiments 基因名称引物序列
hsa-p53 hsa-ALP hsa-OCN hsa-Runx2 hsa-GAPDH F:CAGCACATGACGGAGGTTGT；R:TCATCCAAATACTCCACACGC
F:ACCACCACGAGAGTGAACCA；R:CGTTGTCTGAGTACCAGTCCC F:CAAAGGTGCAGCCTTTGTGTC；R:TCACAGTCCGGATTGAGCTCA F:TGGTTACTGTCATGGCGGGTA；R:TCTCAGATCGTTGAACCTTGCTA F:CCGTTGAATTTGCCGTGA；R:TGATGACCCTTTTGGCTCCC
1・2・5Western blot检测：空腹条件下，收集各实验组外周静脉血5mL,3000r/min离心20min后收集上
清，用lxPBS稀释5倍。在16^L稀释液中加入上样缓冲液44，混匀，在沸水浴中煮5min, 10000r/min离心3min，常温冷却后等体积上样，每孔上样54。用6%SDS-PAGE凝胶将蛋白分离，恒压电泳，浓缩胶80mV，分离胶120mVo PVDF膜电转印，用5%脱脂牛奶在室温条件下封闭1h，随后在分别与p53、ALP、OCN及Runx2（稀释1:1000）一抗在4°C条件下孵育过夜，再用HRP标记的二抗室温孵育1h，最后用Image J对条带进行定量分析。1.2.6骨密度检测：采用美国LUNADPX-MD型双能X线骨密度分析仪对三组受试者腰椎L2〜4、股骨颈（FN）、大转子（GT）、Ward三角区的BMD进行定量检测。
1.2.7骨代谢生化指标：在空腹条件下，用肝素抗凝采血管收集对照组、OP组及ELP组6个月后的外周静脉血5mL，用离心机离心，留取血清，用于检测骨钙素（BGP）、骨源性碱性磷酸酶（BALP）及清晨空腹尿酶免法测定尿脱氧吡啶啉/肌酐（DPD/Cr）比值。
1.3统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行数据分析，组间的比较采用t或光2检验，由“无土s”和“％”表示计数资料与计量资料,P<0.05表示比较差异有统计学意义，采用Pearson's进行相关分析。
2结果
2.1杜仲腰痛丸对p53表达的影响
如图1所示，与对照组（control）相比，OP组受试者血清样品中P53基因表达量显著增加（图1 A），相应地，OP组中p53蛋白的水平也显著增加（图1B）（P<0.01），表明p53在骨质疏松发展中起着重要作用。杜仲腰痛丸6个月后，p53的mRNA及蛋白的水平均明显降低（均P<0.01），提示杜仲腰痛丸可以抑制p53在OP中的表达。
图1p53的mRNA与蛋白的表达
注:A：p53在对照、OP及ELP组后血清中mRNA的水平；B：p53在对照、OP及ELP组后血清中蛋白的水平。与对照组比较，**P<0.01；与OP组比较,##P<0.01。
Fig・1p53mRNA and protein expression
2.2杜仲腰痛丸对BMD的影响
如图2所示，与对照组相比,OP组BMD显著降低（P<0.05），骨量减少。与OP组比较,EPL后腰椎L2~4的BMD显著升高（P<0.01）；而股骨颈（FN）、大转子（GT）及Ward三角区的BMD值无显著变化（P>0.05）o
2.3骨转换生化指标的比较
如表2所示，与OP组相比,ELP组6个月后受试者的BGP、TRAP及DPD/CR水平均明显降低，比较差异具有统计学意义（P<0.01）。
提示杜仲腰痛丸能
■ conhol BOP ■ ELP
L 2.4
FN
GT Ward
图2腰椎L 2~4及股骨颈各部位BMD 值的含量
注：与对照组比较,* P <0.05,** P <0.01；与0P 组比较,##P <0. 01 °
Fig ・ 2 The content of BMD in lumbar spine L 2-4 and
femoral neck
更有效地改善老年骨质疏松症的骨代谢水平°
表2 三组受试者BGP 、BALP 、DPD/CR 的比较(X±s,n =30)
Table 2 Comparison of BGP , BALP , DPD/CR of three groups
(X 土s ,n = 30)
注：与对照组比较，** P <0.01；与OP 组比较,##P <0. 01,* P
分组
BGP/gg/L)BALP/(|±g/L)DPD/CR/(g/moL)
对照组 3. 13±0. 30
10. 05±0.62 6. 02±0. 61
OP 组
6. 58±0.64 **19. 33±0. 89 **10. 97±0. 72 **ELP 组 4. 32±0. 57##
13. 46±0. 59##
8. 10±0. 62##
多态性的作用t 值
14. 4830. 1216. 57
P 值0. 00
0. 00
0. 00
2.4 p53 的表达与 L 2〜4BMD 、BGP 、BALP 及 DPD/CR 含量的相关性
如图3所示，进一步分析发现ELP 组后
p53的表达水平较0P 组显著降低，而L2“BMD 含
量显著升高，两者在P <0.01水平上呈显著负相关,
同时与骨代谢生化指标BGP 、BALP 及DPD/CR 含
量在P <0. 01水平上呈显著正相关。相关性分析表
明杜仲腰痛丸可能通过抑制p53的表达影响老年骨
质疏松症患者的骨密度和骨代谢水平°
2. 5杜仲腰痛丸对成骨细胞MC3T3-E1中p53表
达的影响
如图4所示，与对照组相比，用0.2、0.4、0.8
mg/mL 的ELP 提取液处理 MC3T3-E1 24 h 后,
MC3T3-E1中p53的表达明显降低，且0.4 mg/mL
的ELP 提取液对p53的表达影响最为显著(P <
0. 05)°提示ELP 提取液可以抑制MC3T3-E1中
p53 的表达°
2.6杜仲腰痛丸逆转p53过表达对成骨分化的 抑制
如图5所示，与p53过表达组相比，杜仲腰痛丸
提取液处理的MC3T3-E1中p53的表达明显降低(P <0.05)，见图5 A°此外，与对照组比较，p53过表
<0. 05°
A 2川］
r = - 0.477 P<0.01
(IJH ------------------1--------------------------------------------1------------------1 0
1 2 3Relative p53 expression
4 01 2 3Rela tive p53 expression
4
c
D
25~|
r =0.914 P<0.01
20
J I
o 尸=0.887 p<0.01
«A a l h
po
2三w"
H m d Q
10-1---------------1---------------1---------------1---------------10 12 3 4
Relative p53 expression 6 ------------1------------1------------1------------1
12
3 4
Relative p53 expression
图3 ELP 后p53的表达与L 2〜4BMD 、BGP 、BALP 及DPD/CR 含量的相关性
注:A ：与BMD 含量的相关性；B 与BGP 含量的相关性；C ：与BALP 含量的相关性；D ：与DPD/CR 含量的相关性。
Fig ・3 Correlation of p53 expression with L 2-4BMD , BGP , BALP and DPD/CR content after ELP
treatment
E
tn
dvKHm
e A n E -e H
图4 ELP 处理后p53的表达水平
注：与对照组比较，** P <0. 05o
Fig ・4 p53 expression level after ELP treatment
达显著降低MC3T3-E1中ALP 、OCN 及Runx 2的
mRNA 及蛋白表达水平，且0.4 mg/mL 的杜仲腰痛
丸提取液处理可以逆转p53过表达的影响，显着增
加 ALP 、OCN 和 Runx 2 表达（P <0. 05），见图 5B 、图
5Co 提示杜仲腰痛丸提取液可以抑制MC3T3-E1中
p53的表达，促进骨形成。
3讨论
骨质疏松症是绝经后妇女和老年人常见的一种
广泛的代谢性骨病〔⑹。骨质疏松症可引起疼痛、脊
柱畸形和骨折，甚至可能增加死亡风险〔⑴。因此, 骨质疏松症已成为世界范围内的主要公共卫生问
题，给患者和医疗系统带来了沉重的经济负担［12］。
故对其及机理的研究显得尤为重要。杜仲腰痛
丸是由甘肃中医院研究的经验效方，在OP 中
具有平衡骨代谢、缓解疼痛、消炎消肿等功效⑼。 但是，尚不清楚杜仲腰痛丸对骨骼健康影响的详细
机制。
研究［⑶发现多种基因参与OP 的发病机理。
Liu 等［14］报道了 p53通过miRNA 信号通路影响
MSC 的功能来抑制成骨作用。本研究结果显示,
p53参与OP 的发病，且杜仲腰痛丸可以抑制p53的
表达影响老年骨质疏松症患者的骨密度和骨代谢 水平。
笔者还进行了一项体外研究，结果发现,p53过 表达显著降低MC3T3-E1中骨相关基因mRNA 以及
蛋白的表达水平，但杜仲腰痛丸提取液处理可以逆 转p53过表达的影响及ALP 、OCN 和Runx 2表达
（P <0. 05）o 提示p53过表达抑制骨形成，杜仲腰痛 丸提取液可以逆转p53的抑制作用，促进骨形成。
相关动物研究［⑸也表明下调p53的表达，可以促进
骨形成，纠正OP 大鼠的骨代谢失衡状态。Wang
等［16］的研究表明,p53"-小鼠的成骨细胞功能增强, 呈现高骨量表型，而p53一成骨细胞具有增强的促
进破骨细胞分化的能力，此外，灭活p53足以挽救在 缺乏c-Abl （ 一种与p53相互作用的蛋白）的小鼠中
观察到的成骨细胞分化缺陷。因此,p53是成骨细
胞形成、成骨细胞依赖性破骨细胞形成和骨重塑的
负调控因子。Fujita 等［⑺的研究同样表明，p53基 因可以通过影响OPG 、RANKL 和M-CSF 的表达使
成骨-破骨失衡。在p53基因缺陷的成骨细胞中,
A
ALP
OCN
Runx2
GADPH y d
aAHSaM
39 kDa
ELP p53游达ELP+p53赫达
・p53
游达control
11 kDa 57 kDa
36 kDa
- -
- - -
2 5 15
■ ELP
■ ELP+p53 齒达
B
图5 p53、ALP 、OCN 及Runx 2的表达水平
注:A ：qRT-PCR 检测各组p53表达情况；B 、C ： qRT-PCR 和western blot 检测各组成骨基因的表达。 与对照组比较，** P <0. 01；与p53过表达组比较,##P <0. 01o
Fig ・5 Expression levels of p53 , ALP , OCN and Runx
2
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