基因组学研究在功能基因组中的应用
摘要：20世纪的最后十年，分子生物学研究发生了很大的变革，从单个基因或蛋白质研究转向大规模研究基因，从而产生了基因组学、功能基因组学等新学科。功能基因组学是在结构基因组学丰富信息资源的基础上，应用先进的基因表达技术、生物功能检测技术和生物信息学技术分析研究基因的表达、调控和功能；探讨生物的生长、发育规律的新型交叉学科。目前功能基因组学研究的内容和方法，主要包括应用微点阵、基因表达系列分析（SAGE）、蛋白质组、生物信息学等方法来研究基因组表达概况、基因组多样性、模式生物体等。
关键词：基因组学，功能基因组学，SAGE，蛋白质组学
人类基因组计划的完成意味着从结构基因组学到功能基因组学的跨越，把我们带进了后基因组时代，基因组学的研究发生了翻天覆地的变化已从结构基因组学过渡到功能基因组学。功能基因组学以揭示基因组的功能及调控机制为目标功能基因组学的研究是21世纪国际研究的前沿也是最热门的研究领域之一。本文简要介绍功能基因组学的研究进展尤其是功能基因组学的主要研究内容和研究方法，。
1功能基因组的含义
基因组(genome)这一概念于1924年提出用于描述生物的全部基因和染体组成。基因组学(genomics)由美国科学家ThomasRoderick于1986年提出是指对所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱)核苷酸序列分析基因定位和基因功能分析的一门科学。
结构基因组学(Structural genomics)是基因组学的一个重要组成部分和研究领域它是通过基因作图，核苷酸序列分析以确定基因组成、基因定位的一门科学，结构基因组学代表基因组分析的早期阶段以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。
比较功能基因组学(comparative genomics)是在基因组图谱及序列测定的基础上对已知的基因和基因组结构进行比较以了解基因的功能、表达机理及物种进化的学科。
功能基因组学(functional genomics)被称为后基因组学(post genomics)是利用结构基因组学提供的信息和产物发展和应用新的实验手段通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能使得生物学研究从对单一基因或蛋白质的研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究的一门科学，功能基因组学代表基因组分析的新阶段以高通量、大规模试验方法、统计与计算机分析为主要特征。功能基因组学的近期目标是采用高通量、大规模、自动化的方法加速遗传分析进程；长远目标是避开传统遗传分析的局限采用系统化的途径及数据采集方法阐明复
杂的生物学现象。
2 功能基因组学的研究方法
基因的时空差异表达是植物发育、分化、衰老和抗逆等生命现象的分子基础。基因在不同组织、不同器官以及不同环境条件下的差异表达特征，为基因的功能提供了重要的信息。Velculescu等(1997)将在特定组织或细胞内转录的所有基因及其表达丰度称为转录组(transcriptome)，因此在转录水上进行的基因表达差异分析实际上就是进行转录组研究。经典的减法杂交(subtractive hybridization)，差示筛选(differential screening)，cDNA代表差异分析(representative difference analysis，RDA)以及mRNA差异显示(differential display)等技术已被广泛用于鉴定和克隆差异表达的基因，但是这些技术不能胜任对大量的植物基因进行全面、系统的分析，于是，基因表达的系统分析(serial analysis of gene expression，SAGE)、cDNA微阵列(cDNA microarray)和DNA芯片(DNA chip)等能够大规模地进行基因差异表达分析的技术应运而生。
2.1 基因表达的系统分析( SAGE)
SAGE技术的主要理论依据是:来自cDNA 3′端特定位置的一段9～11bp长的序列能够区分基因组中95%的基因。这一段基因特异的序列被称为SAGE标签(SAGE tag)。通过对cDNA制备SAGE标签并将这些标签串联起来，然后对上述串联起来的SAGE标签进行测序不仅可以显示各SAGE标签所代表的基因在特定组织中是否表达，还可以根据各SAGE标签所出现的频率作为其所代表的基因表达丰度的指标。应用SAGE技术的一个必要前提是GenBank中必须有足够的某一物种的DNA序列资料，尤其是EST序列资料。目前该技术在人类和酵母基因组研究中已得以应用，但是尚未用于植物基因组研究。SAGE技术的不足是不能够检测出稀有转录物。
多态性的作用
2.2 cDNA微阵列和 DNA 芯片技术
cDNA微阵列和DNA芯片都是基于reverse Northern杂交以检测基因表达差异的技术。二者的基本思路都是首先把cDNA，或EST，或基因特异的寡聚核苷酸固定在固相支持物上，并与来自不同细胞、组织或整个器官的mRNA反转录生成的第一链cDNA探针进行杂交，然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析，理论上杂交点的强度基本上反映了其所代表的基因在不同细胞、组织或器官中的相对表达丰度。这两项技术的优点是可以同时对大量基因，
甚至整个基因组的基因的表达差异进行对比分析。cDNA微阵列技术是Schena等(1995)发展起来的，其主要优点是:灵敏度极高，mRNA丰度低至10万分之一仍能被检测出;使用几种不同颜的荧光染料标记探针，这样在同一张阵列膜上进行一次杂交实验就可以同时分析不同细胞间或不同环境胁迫下基因表达的差异。cDNA微阵列技术的主要不足是成本非常高，如需要机器人点膜和特殊的信号检测分析系统，点在玻璃片上的array不能重复使用等。最近，Desprez等和胡玉欣等分别独立发展了利用尼龙膜作固相支持物和使用同位素标记探针进行杂交的cDNA表达阵列技术，从而降低了成本，但检测的灵敏度却降低了(万分之一)。DNA芯片技术是Affymetrix公司率先研制出来的，该技术利用结合化学手段在玻璃固相支持物上原位合成大量的基因特异的寡聚核苷酸，并与荧光标记的探针进行杂交，再利用特殊的检测系统进行信号分析，就可以获得基因的时空差异表达谱，最近Ramsay(1998)对DNA芯片技术的原理和应用进行了较全面的介绍。
2.3 蛋白组( proteome) 研究
转录不是基因表达的最终结果，基因功能的实现最终是以蛋白质的形式体现的。因此，在转录水平上所获取的基因表达的信息有时并不足以揭示该基因在细胞内的确切功能。蛋白组指
的是由基因组表达产生的总蛋白质的统称，由英文单词protein的前半部加上单词genome的后半部组合而成。蛋白质双向电泳是目前蛋白组研究的首选技术（HumpherySmith，1997），但是该技术在以下方面尚需改进：分辨率和可重复性；蛋白质斑点的自动定量检测系统，以及蛋白质N端和内部氨基酸序列测定技术等。
利用蛋白质双向电泳技术对基因敲除(knock-out)突变体或转基因重组体与野生型个体间双向电泳蛋白图谱的差异进行对比分析就可以对目的基因的功能进行分析。在植物上该技术已被用来分离新的基因，Damerval等(1998)分析了玉米Opaque2基因的近等基因系之间的双向电泳蛋白图谱的差异，结果鉴定克隆了一个新的转录激活因子基因。对水稻盐胁迫处理和ABA处理前后的双向电泳蛋白图谱进行的对比分析同样克隆了几个与水稻耐盐性相关的胚胎晚期丰富蛋白(lea)基因。
2.4 反向遗传学研究
传统的遗传学或称为正向遗传学(forward genetics)主要研究自发或诱发突变体中某一突变性状的遗传行为，如控制突变性状的基因的数目及其在染体上的位置、突变性状在后代中的传递规律等。反向遗传学(reverse genetics)是在已知基因序列的基础上研究基因的生物学功
能，一般通过创造功能丧失(loss-of-function)突变体并研究突变所造成的表型效应。在微生物和小鼠中可以通过同源重组的方法用突变的基因取代野生型基因创造功能丧失突变体进行反向遗传学研究，但在植物中很难进行同源重组试验(Puchta H,1996)，不过植物中有成熟的转座子标签(transposon tagging)系统和T-DNA标签系统，而且目前已经获得了拟南芥、金鱼草、番茄、玉米和水稻等植物的转座子插入诱变的突变体体，以及T-DNA插入诱变了的拟南芥突变体体。从这些突变体体中筛选出特异基因被突变了的植株，并对突变株进行表型分析将有助于揭示目的基因的生物学功能。筛选突变体的常用方法是利用PCR技术，这是在果蝇(Ballinger D G,1989)和线虫(C.elegans)(Zwaal R R,1993)中发展起来的比较成熟的方法，其基本思路是根据目的基因的序列设计一个引物，再根据插入元件(转座子或T-DNA)的序列设计第二个引物，用上述引物对突变体体进行PCR扩增，由于只有目的基因插入转座子或T-DNA的突变体才有PCR扩增产物，这样根据扩增产物的有无就可以很容易地从数以千计的突变体体中筛选出所需要的突变体。该技术已经在矮牵牛(Koes R,1995)、玉米(Bensen R T,1995；Mena M，1996)和拟南芥（Krysan P J，1996）等植物中得以成功应用。但是对数以千计的材料进行PCR反应工作量十分巨大，为克服这一困难，Winkler等(1998)设计了利用DNA混合池(pooling)进行突变体筛选的实验程序，结果只需要进行36个PC
R反应就可以从由6000个突变体组成的体中筛选出单个的突变株，大大减轻了筛选的工作量，同时这些突变体的DNA样品及构建的DNA池也可以向其他研究者免费提供。当然，要对基因组中所有的基因进行功能分析所需要的突变体的数目也是十分可观的，理论上，要达到95%的概率使基因组中每一个基因均因插入元件而致突变，则所构建的突变体体中个体的数量至少应为该植物基因总数的5倍左右。
3基因组学在我的课题中的应用
我的课题为山葡萄抗霜霉病候选基因功能验证研究。葡萄是一个具有多样性的体，不同体和个体在生物学性状以及在对疾病的易感性、抗性上的差别，是由于基因序列的差异与内外环境相互作用的结果。这种基因不同的差异极为多态性，最常见的多态性是单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs），葡萄中大约有三万多个基因，编码区的SNPs可能导致蛋白序列的多态性，非编码区的SNPs对评价疾病风险也是重要的。因此在本课题中从表型出发，左山二抗霜霉病而左优红感病，由于二者有较近的亲缘关系分析可能由于突变导致左优红感病，推测基因中某些位点的突变造成了差异，采用DNA再测序的方法识别变异序列，分析SNPs筛选可能参与抗霜霉病的基因，通过PCR扩增得到大量的序列，并
通过测序得到准确的序列，利用瞬时转染或将后候选基因转入烟草中的方法进行候选基因的功能验证。在课题中主要是应用反向遗传学的研究方法，运用生物信息学技术和转基因技术等技术。

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