细胞遗传学产前诊断技术与规范
细胞遗传学是现在应用最为广泛的产前诊断手段，也是诊断染体疾病的金标准。
作者：龙志高 邢恩鸿 王玉琢
来源：《中国实用妇科与产科杂志》
产前诊断是在遗传咨询的基础上，应用现代医学、细胞遗传学、分子遗传学、医学影像学、免疫遗传学、生物化学等技术，对胚胎和胎儿的直接检测或通过对母体的检查，预测胎儿在子宫内生长发育状况，诊断胎儿是否有遗传缺陷及先天畸形，并提出医学建议，是预防出生缺陷患儿出生的有效手段。其中细胞遗传学是现在应用最为广泛的产前诊断手段，也是诊断染体疾病的金标准。本文对细胞遗传学产前诊断的应用及技术规范做一介绍。
1、人类非显带染体技术与各类显带技术的应用
1.1 非显带染体技术
非显带技术始于20世纪50年代末，经非显带技术染后的染体呈均匀着，其主要的特征为
着丝粒的位置和染体的相对长度。应用这一技术可以发现整倍体和部分非整倍体性核型，如21-三体综合征、Ph染体等。但由于缺乏显带技术，无法精确辨认某一染体的异常，只是在1960年Denver会议上依据染体大小将其分为7组（A~G），并于1967年进一步修正，命名了染体的臂、易位和其他异常。进入70年代，随着方法学上的进展，尤其是G、Q及R显带技术的应用，许多染体的数目及结构异常才得以精确地辨认。
1.2 各类显带染体技术
非显带的标本上虽然可以根据染体的形态识别1、2、3、16、17和18号，有时还可以识别Y染体，但不能鉴别其他大多数染体。1970年Caspersson等首次报道用喹吖因对人染体进行染，可在各号染体上显示出宽窄和位置不同带纹，在随后几年中，细胞遗传学工作者以不同的染方法为基础，提出了各种显带方法和名称，如Q、G、R、C、T及N显带法等。
1.2.1 G显带技术
G显带是最常用的，染体经胰蛋白酶处理后，用一种能结合DNA的化学染料Giemsa染，使染体呈深浅不同的带型，人类的24种染体可显示出各自特异的带纹。
1.2.2 G-11显带技术
G-11显带是一种特异性显示9号染体次缢痕的显带方法，一般用于9号染体次缢痕多态性分析、家系调查、亲子鉴定等研究以及9号染体倒位的细胞遗传学分析。
1.2.3 R显带技术
R显带与G显带相反，染体经热盐处理，使富含AT的DNA变性，用Giemsa染，则可显示与G带正好相反的带纹，即G显带的深带变为浅带，浅带染成深带。当G显带显示的染体两臂末端为浅带时，如果两臂末端发生缺失等异常，一般难以发现和识别，而R带正好能将此处显示出易于识别的深带。所以，R显带技术有利于检测染体的末端缺失、重排等。
1.2.4 C显带技术
C显带技术由Arrighi和Hsu于1971年发明，是显带技术中最简单的一种带型。其方法起源于原位杂交。Arrighi和Hsu发现用碱处理载玻片上的染体使DNA变性后，再在SSC溶液中、65℃的条件下使其复性，在受控制的条件下经Giemsa染可显示出在染体的一定部位是深染的。20世纪70年代用原位杂交的方法证明深染的区域（C带区）是结构异染质的区域，
也就是一般而言的DNA高度重复序列的区域。然而，现在更为流行的看法认为氢氧化钡或其他碱性物质的处理是优先提取了非C带区的DNA，SSC的处理有助于带型的清晰。
1.2.5 N显带技术
人类的近端着丝粒染体（13、14、15、21和22号染体）的次缢痕处与核仁的形成有关，故称为核仁形成区，它是中期染体上的明显结构之一。应用DNA-RNA分子杂交技术，证明人类的18S和28S核糖体（rRNA编码结构）的基因（rDNA）位于核仁形成区。目前已有多种技术可以显示中期染体上的核仁形成区。其中最简单而又准确的方法是银染法，即利用硝酸银将具有转录活性的核仁形成区（rRNA基因）特异性地染成黑，人们将这种银染阳性的核仁形成区称为Ag-NOR，它们是具有转录活性的18SrRNA基因和28SrRNA基因所在的部位。由于具有转录活性的rRNA基因（rDNA）往往伴有丰富的酸性蛋白质，该类蛋白质含有巯基（-SH)和二硫键（-S-S-），能使AgNO3中的Ag+还原成Ag颗粒。因此，有转录活性的核仁形成区常被镀上银颗粒而呈现黑，没有转录活性的核仁形成区则不着。故其着程度与细胞中rRNA基因的转录活性相一致。在同一物种，Ag-NOR的数目以及它们在染体上的位置是相对恒定的，如果发生了改变就意味着rRNA基因的活性发生了变
化，故此项技术是目前探讨rRNA基因功能的方法之一。此外，人类近端着丝粒染体的随体间易发生联合，这种联合可能是造成近端染体不分离、断裂和易位的原因。利用银染技术可在发生联合的染体间清楚地看到有银染物质相连。因此，银染近段着丝粒染体联合可以作为准确地判断人体细胞是否存在近段着丝粒染体随体联合的客观标准。
1.2.6 T显带技术
端粒是维持染体正常复制和上下代传递的3个基本功能单位之一。它的功能包括确保染体末端的正常复制；防止断裂的DNA与染体末端的重组。它们也是哺乳类动物生殖细胞减数第1次分裂时同源染体配对的起始部位。每次细胞分裂，染体丢失其末端的约100bp核苷酸，此变短的端粒可为细胞提供一有丝分裂的时钟。丢失的端粒序列可经端粒酶的作用逐个加回。T显带技术专门显示染体端粒，可用于分析染体端粒有无缺失、易位等畸变。T显带是R显带的亚类，因为特别地着在端粒而称为T显带。T带是R带的最深染部分，必须用特殊的高热处理染体，然后用Giemsa或荧光联合染。
1.2.7 各种带型的关系
经Q染和G显带处理的染体，在两臂上深带和浅带的分布基本一致，这种一致性提示了两臂上相应节段的一定结构和一定染反应，R带型是Q带和G带型的反式，深带和浅带刚好颠倒，有助于探索Q带型和G带型浅染区的情况，特别是查明两臂末端的变化情况。T带也能反映染体两端的畸变，C带型只限于着丝粒附近区段和几条染体的次缢痕，N带仅在D、G组的特异区段显示。这是Q显带技术所不能显示的。所以上述各种带型联合起来，可以比较全面地反映染体各个节段的结构和畸变，它们互相补充而不是互相矛盾。在实际工作中，如果有条件，最好联合采用几种显带技术，以便查明染体变化的全貌。
1.2.8 特殊显带技术
染体多态性1.2.8.1 妹染单体互换技术
妹染单体互换技术（sister chromatid exchange，SCE）是指一条染体的两条妹染单体之间同源片段的交换。这种交换是对等的、完全的，而且往往是对称性的。它实际上表示染体复制过程中DNA双链的等位点交换。因此，它能敏感地显示出DNA的损伤。SCE虽然在真核生物细胞中以一定的频率发生，但在常规制备染体标本中却不能观察到。1973年Latt等发现，在含5-溴脱氧尿嘧啶核苷酸的培养基中生长的两个同期细胞，其染体标本
经某些荧光染料或Giemsa染后，在妹染单体之间显示出不同的着强度，从而可用于检测SCE。

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