3种杓兰属植物菌根真菌系统发育和多样性分析
徐玲玲; 赵桂仿; 孙敬祖; 张焱; 高丽君
【期刊名称】《《西北植物学报》》
【年(卷),期】2019(039)008
【总页数】9页(P1400-1408)
【关键词】菌丝团; 克隆文库; 系统发育树
【作 者】徐玲玲; 赵桂仿; 孙敬祖; 张焱; 高丽君
【作者单位】西安文理学院 生物与环境工程学院 植物微生物协同研究重点实验室  西安 710065; 西北大学 生命科学学院 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室  西安 710069; 中国科学院 微生物研究所 真菌学国家重点实验室  北京 100101; 广西大学 农学院 食用菌研究所  南宁 530005
【正文语种】中 文
【中图分类】Q93-331; Q789
杓兰属(Cypripedium L.)是兰科植物(Orchidaceae)中比较原始的类，中国是杓兰属植物的分布中心[1]。在自然条件下，兰科植物种子萌发和随后生长发育都需要通过与兰科菌根真菌(Orchid mycorrhizal fungi, OrMF)建立共生关系，以获得碳源[2-3]。目前已经报道的大多数兰科植物的菌根真菌以胶膜菌科(Tulasnellaceae)、腊壳菌科(Sebacinaceae)、Serendipitaceae和角担菌科(Ceratobasidiaceae)为主，其无性型都属于丝核菌样(Rhizoctonia-like)真菌[4]，在人工培养基上会形成念珠状(Moniliod)菌丝[5-6]。另外还有革菌科(Thelephoraceae)、鬼伞科(Psathyrellaceae)和红菇科(Russulaceae)等，也有少量子囊菌类[4,7-11]。
spss中bootstrap结果解读杓兰属植物与胶膜菌在科的水平上具有专一性[12]，在科的水平以下则与多种类的胶膜菌共生[10]。与哪些类的胶膜菌共生，由不同杓兰属植物对OrMF的偏好性[12-13]和生长环境决定，环境因素中影响最大的是土壤中OrMF的分布[14]。
大多数OrMF定殖兰科植物后，在根皮层细胞内以结状或者螺旋状的菌丝团(Peloton)形式存在。以往OrMF的分离主要采用表面灭菌后的根段横切切片在低营养培养基中培养获得真菌
菌株的组织切片法[15-17]，但因为兰科植物根中除了OrMF，还有大量其他内生真菌存在，因此该方法分离获得菌根真菌的效率并不高。随着菌根真菌分离技术的改进，直接挑取根细胞内菌丝团进行培养的方法得到了广泛应用[18-19]。这种方法不需要使用任何化学试剂，且能避免杂菌污染。
直接分离培养OrMF方法的优点是可以获得可培养的OrMF菌株，其缺点是对于生长缓慢和不可培养的OrMF分离效果不好。而这类OrMF可能包含OrMF落更多的多样性信息。因此，利用OrMF ITS特异性引物从兰科植物根DNA中直接扩增获得OrMF ITS序列是近年发展起来的新方法[20-21]，已经筛选出有效的特异性引物并广泛用于OrMF系统发育研究[4]。
本研究采集四川黄龙沟西藏杓兰(Cypripedium tibeticum)，黄花杓兰(C. flavum)和无苞杓兰(C. bardolphianum)的根，研究(1)直接分离菌丝团培养法和OrMF特异性ITS引物扩增建立克隆文库的非培养方法得到的OrMF区系和系统发育关系，并比较两种方法的效果；(2)同一栖息地3种不同杓兰OrMF的多样性和落结构。
1 材料和方法
1.1 样品采集
2015年6月于四川黄龙自然保护区内黄龙沟(103°44′E，32°39′N)杓兰分布区(海拔3 170～3 400 m)设置20个样方，分别采集每个样方中西藏杓兰，黄花杓兰和无苞杓兰的根。每个样方采集每种杓兰5株植株的根，每个植株采集3个根，用苔藓包裹，回到住地后用显微镜观察选取有菌根真菌定殖的根段并分成两部分：一部分用无纺布茶叶袋装好，放进装有硅胶的自封袋中干燥保存；另一部分继续用苔藓包裹，于4 ℃冰箱中保存，10 d内带回实验室进行菌根真菌分离。
1.2 菌根真菌的分离、纯化和鉴定
采用菌丝团分离法进行OrMF的分离和纯化[18]。提取真菌DNA并进行PCR扩增，引物为ITS5/ITS4。PCR扩增的循环步骤为94 ℃预变性3 min，35 次循环：95 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，最后72 ℃ 延伸10 min。将PCR产物切胶回收后送上海生工生物工程股份有限公司测序，ITS5和ITS4作为测序引物进行双向测序，对于序列不一致的菌株再加测一个反应，以消除测序误差造成的影响。代表性序列提交NCBI GenBank数据库获得登录号(表1)。将ITS序列在NCBI数据库中进行比对，选取相似性较高的序列用于分子鉴定。
1.3 克隆文库的构建和测序
将采集的干燥的杓兰根剪成长度为0.5 cm的小段完全混合均匀后，随机称取50 mg根段用于DNA提取。OrMF特异性引物[4]进行PCR扩增。PCR扩增的循环步骤同1.2。PCR产物回收纯化后，用pGM-T载体试剂盒(pGM-T Ligation Kit，Tiangen, China)进行亚克隆。随机挑取每个样方每种杓兰至少40个阳性克隆，送上海生工生物工程股份有限公司进行测序，用引物T7和SP6作为测序引物双向测序。代表性序列提交NCBI GenBank数据库获得登录号(表1)。将ITS序列在NCBI数据库中进行比对，选取相似性较高的序列用于分子鉴定。
1.4 OTU的划分和系统发育树的构建
以97%的一致性用于OTU划分[22-23]。以Multiclavula vernalis和Multiclavula corynoides[9, 13]作为外类分析真菌ITS序列系统发育关系。用Clustal X1.81[24]进行比对，MrBayes 3.1.2[25]构建系统发育树。Modeltest 3.7进行最佳模型检验，最佳模型为GTR+I+G，确定系统发育树参数为Nst=6，Rates=invgamma。取样代数(sample freq)为1 000，马尔可夫链运行链数(nchains)为4，舍弃(burnin)掉前3棵树(前2 000代)。用软件Tracer version 1.4打开MrBayes运行结果中的P文件来评价各参数是否合理以及结果是否达到稳态。
1.5 不同杓兰OrMF物种丰富度和落分化程度
将非培养法得到OrMF OTU用3个非参数估计量(Non-parametric estimators)：Chao1、first-order Jacknife 1 (Jack 1)和 Bootstrap[26-28]分别对3种杓兰物种丰富度(α多样性)进行估算。用SPSS 19软件进行卡方检验(χ2)比较两两杓兰间OrMF落丰富度差异是否显著。用Jaccard和Sørensen指数[29-30]比较两两杓兰间OrMF落分化程度(β多样性)。2个指数都是基于2个落共享的OTU数量除以每个落独特OTU数量。Jaccard和Sørensen指数值在0～1之间，数值越大落相似度越高，越接近0差异越大。
2 结果与分析
2.1 菌根真菌的分离
所有根段中都有菌丝团分布(图1，A)。共分离出菌根真菌64株，其中63株为胶膜菌科(Tulasnellaceae)真菌，1株为角担菌科(Ceratobasidiaceae)真菌(表1、2)，可划分为7个OTU(表2)。每个OTU代表菌株的菌丝都能形成OrMF典型的近球形或椭球形链状排列的念珠状细胞(图1， B～H)。分离出来的菌根真菌均为无性型菌丝且不产生无性孢子。
A.杓兰根中的菌丝团(箭头所指)；B～H分别为OTU IT1、IT2、T2、T3、T4、T6和C1代表菌
株形成的念珠样菌丝。标尺表示A、D、E和H =50 μm；B、C、F和G=20 μm图1 菌根真菌的分离A. Peletons in roots of three Cypripedium species (indicated by the arrow); B-H Monilioid mycelia formed by representative isolates of OTU IT1, IT2, T2, T3, T4, T6 and C1, respectively. Bars A, D, E and H=50 μm; B, C, F and G =20 μmFig.1 Mycorrhizal fungal isolation
2.2 2种方法得到杓兰OrMF的区系组成和系统发育关系
培养方法分离得到64个OrMF菌株，划分为7个OTU(表2)。通过在NCBI进行BLAST分析，6个OTU(T2-T4、T6、IT1和IT2)与胶膜菌科(Tulasnellaceae)真菌相似性最高，占绝对优势(98.43%)，1个OTU C1与腊壳菌科(Ceratobasidiaceae)真菌相似性最高。OTU T6的菌株数最多，共33株，占比51.56%；其次是OTU T2，占比20.31%。西藏杓兰、黄花杓兰和无苞杓兰的OTU类型分别为6、0和3个(表2)。黄花杓兰在根中存在大量菌丝团，但没有菌丝团成活。
非培养法共得到OrMF ITS序列1 579条，可划分为18个OTU(表1、3)。通过在NCBI进行BLAST分析，14个OTU(T1-T14)与胶膜菌科(Tulasnellaceae)真菌相似性最高，占绝对优势(
99.62%)，2个OTU(S15, S16)与腊壳菌科(Sebacinaceae)真菌相似性最高，2个OTU(Th17，Th18)与革菌科(Thelephoraceae)真菌相似性最高。西藏杓兰、黄花杓兰和无苞杓兰的OTU类型分别为15、6和8个(表3)。
所有胶膜菌OTU类型在西藏杓兰中都有分布(表2、3，图2)。OTU T2-T4和T6用2种方法均能获得，且在2种方法中其数量都占有优势(表2、3)。OTU T4在2种方法中其菌株数或OTU序列数量在无苞杓兰中较西藏杓兰高(表2、3)，OTU T1在非培养法得到的序列数量较西藏杓兰高，OTU T3和T7在黄花杓兰较西藏杓兰高。其他胶膜菌OTU菌株数或序列数西藏杓兰都较另外2种杓兰高。2种方法得到的3种杓兰的OTU类型和数量均为西藏杓兰>无苞杓兰>黄花杓兰，非培养法得到的OTU类型和数量均多于培养法(表2、3)。除了胶膜菌，培养法得到一个与腊壳菌科真菌相似性最高OTU C1，而非培养法得到与角担菌科真菌相似性最高的OTU 2个以及与革菌科真菌相似性最高的OTU 2个。

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