ox-LDL诱的Raw264.7因子表达变化
及PPAR7Ser273磷酸化调控作用观察
，方涛，苏卫东，刘勇，李焕明
天津市第四中心医院，天津300140
摘要：目的观察氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株Raw264.7炎症因子的表达变化及PPAR7Ser273磷酸化的调控作用，探讨PPAR7Ser273磷酸化在动脉粥样硬化(AS)中的作用。方法
取Raw264.7细胞并分为ox-LDL组和对照组,ox-LDL组以50mg/L ox-LDL诱导，对照组不予处理，采用ELISA法检测两组细胞培养液中的TNF-a、IL-1p,Western blot法检测细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体7(PPARy)和PPAR7Ser273磷酸化蛋白，计算PPAR7Ser273磷酸化与PPAR7蛋白相对表达量的比值。取缺陷型Raw264.71胞并分为4组,S273A+ox-LDL组细胞经PPAR7Ser273突变粒转染，并以50mg/L ox-LDL诱导；S273A组细胞经PPAR7Ser273突变型质粒转染，但不予50mg/L ox-LDL诱导；WT+ox-LDL组经PPARy野生型质粒转染，并以50 mg/L ox-LDL诱导；WT组经PPARy野生型质粒转染，但不予50mg/L ox-LDL诱导；采用ELISA法检测细胞培养液中TNF-a和IL-1p分泌量，实时定量PCR法检测细胞中TNF-a和IL-
1p mRNA。结果ox-LDL组和对照组TNF-a的分泌量分别为229.43士10.92、186.85士16.12,IL-1p分泌量分别为69.68士6.87、54.80±3.27, PPAR7Ser273磷酸化与PPARy蛋白相对表达量的比值为0.67±0.06,0.55±0.01，两组比较,P均＜0.05。S273A +ox-LDL组、S273A组、WT+ox-LDL组、WT组TNF-a分泌量分别为333.05±41.44,251.47±24.73,445.68士
31.63,73.64±37.59,TNF-a mRNA相对表达量分别为1.35±0.28,0.63±0.12,2.37±0.21,1.00±0.00,IL-1p
分泌量分别为83.25±4.74,7.56±6.14,110.73±10.01,4.47±7.48,IL-1p mRNA相对表达量分别为1.18±
0.09,0.67±0.13,1.55±0.15,1.00±0.00,S273A+ox-LDL组与WT+ox-LDL组比较,S273A组与WT组比较,P
均＜0.05。结论PPAR7Ser273磷酸化通过促进ox-LDL诱导的Raw264.7细胞炎症因子TNF-a和IL-1p的分泌和表达,AS进程。
关键词：氧化低密度脂蛋白；小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株;Raw264.7细胞；肿瘤坏死
因子a；白细胞介素1p；过氧化物酶体增殖物激活受体7Ser273；动脉粥样硬化
doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2020.24.007
中图分类号:R541.4文献标志码:A文章编号：1002-266X(2020)24-0027-05
Expression changes of inflammatory cytokines in mouse monocytic macrophage leukemia
cell line Raw264.7induced by oxidized low-density lipoprotein and regulation of PPAR y
Ser273phosphorylation
SHEN Na,FANG Tao,SU Weidong,LIU Yong,LI Huanming
Tianjin4th Central Hospital,Tianjin300140,China
Abstract:Objective To observe the changes of inflammatory factors in mouse monocyte macrophage leukemia cell line Raw264.7induced by oxidized low-density lipoprotein(ox-LDL)and the regulation of PPAR了Ser273phosphorylation in order to explore the role of PPAR y Ser273phosphorylation in athero
sclerosis.Methods The mouse monocyte macrophage leukemia cell line Raw264.7were divided into the ox-LDL group and control group.The cells in the ox-LDL group were induced by50mg/L ox-LDL,while the cells in the control group were not treated.The concentrations of inflammatory cytokines tumor necrosis factor-a(TNF-a/and interleukin-1p(IL-1p)in the cell culture medium of the two groups were detected by ELISA.The relative expression levels of peroxisome proliferator-activated receptor了(PPAR了)and PPAR了Ser273phosphorylated protein was detected by Western blotting.The ratio of relative expression of PPAR了Ser273phosphorylation to PPAR了protein was calculated.The PPAR y Ser273mutant and PPAR y wild type plasmids were transferred
基金项目：中国中青究基金-VG基金(2017-CCA-VG-021)；天津市慢性病防治大专(17ZXMFSY00200)。
第一作者简介：沈娜(1989-)，女，硕士,，究方向为实验室检验、心血管相关基础研究。E-mail：
通信作者简介：李焕明(1970-)，男，硕士，，究方向为心血管。E-mail：
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into PPAR y deficient Raw264.7cells and were divided into the S273A+ox-LDL group,S273A group,WT
+ox-LDL group,and WT group.Cells in the S273A+ox-LDL group and WT+ox-LDL group were induced by50mg/Lox-LDL, while cells in the S273A group and WT group were not treated.The concentrations of inflammatory cytokines TNF-a and IL-1p in cell culture medium of the above four groups were detected by ELISA,and the relative mRNA expression levels of TNF-a and IL-1p in cells were detected by real-time fluorescence quantitative PCR.Results The secretion of TNF-a in the ox-LDL group and control group was229.43±10.92and186.85±16.12,respectively;the secretion of IL-1p was 69.68±6.87and54.80±3.27,respectively;the ratios of relative expression of PPAR y Ser273phosphorylation to PPAR y protein were0.67±0.06and0.55± 0.02,respectively(both P<0.05),with statistically significant difference between these two groups(all P<0.05).The secretion of TNF-a in the S273A+ox-LDL group,S273A group,WT+ox-LDL group,and WT group was333.05±41.44,251.47±24.73,445.68±31.63,and373.64±37.59,respectively; the relative expression levels of TNF-a mRNA were1.35±0.28,0.63±0.12, 2.37±0.21,and1.00±0.00,respectively;the secretion of IL-1p was83.25±4.74，67.56±6.14，110.73±10.01，and94.47±7.48，respectively;the relative expression levels of IL-1p were1.18±0.09，0.67±0.13，1.55±0.15，and1.00±0.00，respectively;significant difference was found between the Ser273A+ox-LDL group and WT+ox-LDLgroup，and between the Ser273A group and WT group(all P<0.05).Conclusion PPAR y Ser273phosphorylation promotes atherosclerosis by promoting the secretion and expression of inflammatory cytokines TNF-a and IL-1p in Raw264.7cells induced by ox-LDL.
Key words:oxidized low-density lipoprotein；mouse monocyte macrophage leukemia cell line;Raw264.7cells; tumor necrosis factor-a;interleukin-1p;peroxisome proliferator-activated receptor y Ser273;atherosclerosis
动脉粥样硬化（AS）是一种脂质异常触发的动脉内膜慢性炎症性疾病，巨噬细胞所介导的炎症反应在AS的发生发展中发挥关键作用。既往研究［，］表明，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）可诱导巨噬细胞发生炎症，细胞中TNF-a、IL-1p等促炎因子呈高表达。研究［,］显示，PPARy对心血管疾病具有一定的保护作用，具有减轻氧化应激、抑制炎症反应、改善糖脂代谢、拮抗细胞凋亡等功能，与AS的发生发展呈负相关。此外还有研究发现,PPARy磷酸化对AS也具有调节作用，CDK5介导的PPARySer273磷酸化可调节多种与AS相关的脂肪因子的释放，如脂联素、瘦素、抵抗素、内脂素等［~8］，间接促进了AS发生发展，拮抗了PPARy的抗AS作用。然而，PPARySer273磷酸化对AS的直接作用仍不明确。2018年9月~2019年12月，我们观察了ox-LDL诱导后小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株Raw264.7中炎症因子表达变化和PPARySer273磷酸化,PPARySer273磷酸化是否通过促进ox-LDL诱导的巨噬细胞炎症反应起到促进AS的作用。
1材料与方法
1.1细胞、主要试剂及仪器Raw264.7细胞（中国科学院上海细胞库）,93T细胞（南开大学分子病毒学实
验室惠赠）。DMEM培养基（美国Gibco公司），标准胎牛血清（美国Hyclone公司），EDTA-胰蛋白酶消化液（北京Solarbio公司），氧化低密度脂蛋白（广州奕元生物技术有限公司），pPPARy（美国New England Peptide公司）,PPARy、p-actin（美国28Abcam司），化物标的抗、抗鼠IgG（北京Solarbio公司），TNF-a酶联免疫吸附试剂盒（美国R&D Systems公司）,IL-1p酶联免疫吸附试剂盒（加拿大Anogen-Yes Biotech公司）,Lipo-fectamine TM2000转染试剂（美国Thermofisher公司），总RNA提取试剂盒（美国Qiagen公司），cDNA 合成试剂盒（日本Takara公司），qPCR试剂盒（美国Promega公司），引物（上海生工生物工程股份有限公司）0CO2培养箱、生物安全柜（美国Thermo Fisher公司），电泳仪（美国Bio-Rad公司），PCR仪（瑞士Roche公司），酶标仪（瑞士Tecan公司）。
1.2ox-LDL诱导后Raw264.7细胞炎症因子和PPARySer273磷酸化检测①Raw264.7细胞炎症因子TNF-a和IL-1p分泌量检测：取对数期生长的Raw264.7细胞，以5X105个细胞/孔接种于6孔板中，每孔加入2mL完全培养基（90%DMEM培养基+10%标准胎牛血清），于37C、5%CO2的环境的培养箱中培养。待细胞融合至70%左右进行分组，将实验分为ox-LDL组和对照组,ox-LDL组加入50 mg/L的ox-LDL诱导，对照组则不予任何处理,4h 后，采用ELISA法检测细胞培养液中炎症因子TNF-a和IL-10的浓度。收集上述两组细胞的培养液，置于EP管中，以3000r/min速度离心5min，分别按照TNF-a和IL-1p试剂盒说明书进行操作，每个样品设置2个复孔。于酶标仪450nm处读取各孔吸光度值，以标准品吸光度值为横坐标，浓度为纵坐标绘制标准曲线，计算各孔样品浓度值（pg/mL），每组重复3次，取平均值。②Raw264.7细胞中
PPARySer273磷酸化水平检测:Raw264.7细胞培养、分组和干预方法同"①”。采用Western blot法检测PPARy和PPARySer273磷酸化蛋白的相对表达量0将各组细胞收集至1.5mL的EP管中，使用含1%PMSF的RIPA裂解液，于摇床上4C裂解30min，裂解结束后，离心吸取上清，即为细胞总蛋白。以BCA法测定各组蛋白浓度，加入适量蛋白上样缓冲液。样品蛋白经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，将PVDF膜置于10%脱脂奶粉中室温封闭1h,—抗（兔抗pPPARy.PPARy均为1：1000，鼠抗p-actin为1：10000）室温孵育3h,HRP偶联的二抗（1：10000）室温孵育45min,ECL法显后于凝胶成像仪中成像，以p-actin作为内参，使用Image Lab软件分析各组蛋白条带的灰度值，计算PPARySer273磷酸化与PPARy蛋白相对表达量的比值，作为PPARySer273磷酸化水平，每组重复3次，取平均值。
1.3PPARySer273位点突变后Raw264.7细胞炎症因子分泌量.mRNA检测①构建并筛选PPARy 缺陷型Raw264.7细胞:a.使用293T细胞构建逆转录病毒颗粒。取对数期生长的293T细胞，以5X 105个细胞/孔接种于6孔板中，待细胞融合至60%时进行分组，实验分为实验组和无关对照组，实验组取水泡型口炎病毒G蛋白包膜蛋白质粒、莫罗尼白血病病毒包装质粒和PPARy缺陷型重组质粒稀释至1Rg/r L,]1：2：2的比例与lipo2000混匀共转染293T细胞,8h后收集上清，以12000r/min速度离20min PPARy陷毒颗粒；无关对照组重组质粒为无关对照质粒，其余处理方式同实验组。b.用上述病毒颗粒感染Raw264.7细胞。取对数期生长的Raw264.7细胞，以5X105个细胞/孔接种于6孔板中，待细胞融合至70%时进行分组，实验分为实验组、无关对照组和未处理组。实验组取出1mL培养基后，加入含PPARy缺陷型病毒颗粒的培
养基（500r L病毒颗粒+1r L polybrene+ 499r L DMEM完全培养基），以3000r/min离心10min提高感染效率。24h后，加入2Rg/mL瞟吟霉素筛选出稳定表达PPARy缺陷型细胞系；无关对照组加入含无关对照的病毒颗粒，其他处理方法同实验组；未处理组不予任何处理。c.观察PPARy沉默情况。取“①b”中的3组细胞，利用“1.2”中的方法蛋白并检测PPARy蛋白的相对表达，与无
关对照组和未处理组比较，实验组未检出PPARy表达，表明PPARy沉默成功。②构建并筛选PPARySer273突变和PPARy Raw264.7胞:a.制备PPARySer273突变型和PPARy野生型病毒颗粒，方法同“①a”。b.用上述病毒颗粒感染PPARy陷Raw264.7。对数的PPARy缺陷型Raw264.7细胞，以5X105个细胞/孔接种于6孔板中，待细胞融合至70%时进行分组, S273A+ox-LDL组细胞经PPARySer273突变型质粒转染，并以50mg/L ox-LDL诱导；S273A组细胞经PPARySer273突变型质粒转染，但不予50mg/L ox-LDL诱；WT+ox-LDL组经PPARy粒
染，并以50mg/L ox-LDL诱导；WT组组经PPARy 野生型质粒转染，但不予50mg/L ox-LDL诱导；其余处理方式同“①b”。c.观察PPARySer273突变型和PPARy野生型Raw264.7细胞构建情况。取上述“②b”中的S273A组和WT组细胞，利用“1.2”中的方法进行蛋白提取并检测各组细胞PPARy和PPARySer273磷酸化蛋白的相对表达量，两组PPARy蛋白相对表达量无差异，而与WT组相比, S273A组不再检测出磷酸化，说明细胞系构建成功。
③PPARySer273位点突变后Raw264.7细胞炎症因子分检测：对数的PPARySer273突变型和PPARy野生型Raw264.7细胞，分别以5X105个细胞/孔接种于6孔板中，待细胞融合至70%左右进行分组，实验分为S273A+ox-LDL组、S273A 组、WT+ox-LDL组、WT组。S273A+ox-LDL组和WT+ox-LDL组分别加入50mg/L的ox-LDL诱导, S273A组和WT组不予任何处理，24h后，采用ELISA法检测各组细胞培养液中炎症因子TNF-a 和IL-1p的浓度，方法同“1.2”。④PPARySer273位点突变后Raw264.7细胞中TNF-a、IL-1p mRNA检测：细胞培养、分组和干预方法同“③”。采用PCR法检测各组细胞中TNF-a和IL-1p的mRNA的相对表达量，首先使用RNeasy Mini Kit提取各组细胞总RNA，随后用PrimeScript RT-PCR Kit将其反转录为cDNA。引物:TNF-a：上游5'-GATCGGTCCCCAAAGGGATG-3'，下游5'-GTGGTTTGCTACGACGTGGG-3',IL-10：上游5'-ATGCCACCTTTTGACAGTGATG-3'，下游5'-TGATGT-GCTGCTGCGAGATT-3'。Promega GoTaq qPCR Master Mix试剂盒说明书进行目的基因扩增，反应体系:RNase Free Water7.2r L，上游引物0.4r L，下游引物0.4RL,GoTaq qPCR Master Mix10r L，模板cDNA2r L。反应条件：95C预变性2min，循环反应设置为95C、15s,60C、1min,50个循环。反应结束后，得出各组样品的Ct值，以p-actin为内参，利用2-AA Ct法计算目的基因的相对表达量，每组重3次，均值。
29
1.4统计学方法采用SPSS18.0统计软件。计量资料以x±s表示，两组间比较用t检验，多组间比较采用单
因素方差分析，进一步两两比较使用LSD-t 检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1ox-LDL诱导后Raw264.7细胞TNF-a、IL-1p 分泌量、PPAR7Ser273磷酸化水平比较ox-LDL诱
导后Raw264.7细胞TNF-a,IL-10分泌量、PPAR7Ser273磷酸化水平比较见表1。表1ox-LDL诱导后Raw264.7细胞TNF-a x IL-1p分泌量、PPAR7Ser273磷酸化水平比较（珔±s）
组别TNF-a(pg/mL)IL-1p(pg/mL)pPPAR7/PPAR y ox-LDL组229.43±10.92*
对照组186.85±16.12
69.68±6.87*ox
54.80±3.27
0.67±0.06*
0.55±0.01
注：与对照组比较，*P<0.05。
2.2PPAR7Ser273位点突变后Raw264.7细胞TNF-a、IL-10分泌量、mRNA表达水平比较PPAR7Ser273位点突变后Raw264.7细胞TNF-a, IL-1p分泌量、mRNA表达水平比较见表2o
表2PPARWer273位点突变后Raw264.7巨噬细胞TNF-a x IL-1p分泌量和mRNA比较（珔±s）
组别TNF-a分泌量(pg/mL)TNF-a mRNA IL-1p分泌量(pg/mL)IL-1p mRNA S273A+ox-LDL组333.05±41.44# 1.35±0.28#83.25± 4.74# 1.18±0.09# S273A组251.47±24.73*0.63±0.12*67.56± 6.14*0.67±0.13* WT+ox-LDL组445.68±31.63 2.37±0.21110.73±10.01 1.55±0.15 WT组373.64±37.59 1.00±0.0094.47±7.48 1.00±0.00
注：与WT+ox-LDL组比较，P<0.05；与WT组比较，*P<0.05
3讨论
心血管疾病是威胁人类健康的主要疾病，随着生活水平的迅速提高和生活方式的巨大改变，心血管疾病的发病率和死亡率显著上升⑼，AS是多种心血管疾病的病理基础，巨噬细胞作为AS核心细胞，在AS整个疾病过程中都发挥重要作用，包括单核巨噬细胞募集、巨噬细胞泡沫化、巨噬细胞增殖、凋亡、极化、坏死等，这些功能的综合作用决定了疾病的进展与消退。小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株Raw264.7是一种常见的AS模型细胞，在泡沫细胞形成、炎症反应、氧化应激、巨噬细胞迁移等方面均
有研究［0~12］。此外,Raw264.7细胞易于培养，转染效率高，因此本研究选择此细胞作为研究对象，进行验。
TNF-a和IL-1p是AS相关炎症因子，AS患者外周血中TNF-a、IL-1p均呈高水平状态［3］。研究［14］显示,TNF-a可通过增加LDL跨内皮细胞的转运使其在血管壁滞留，促进AS的发生。Yuan等［15］也指出TNF-a加速了巨噬细胞向泡沫细胞的转化，诱导AS脂纹形成。IL-10也被证明具有促AS的作用，一项大型双盲研究中指出IL-10抗体卡那奴单抗可通过降低IL-10活性改善心肌梗死患者的预后，并降低炎症标志物水平［16］，细胞和动物实验均证实，靶向IL-10抗体能够抑制AS炎症因子的分泌，减小病变面积［17］。因此，针对于TNF-a和IL-1p 的机制研究越来越受到关注。ox-LDL是一种诱发斑块炎症的标志物［18］，一方面其通过启动TLRs信号通路使巨噬细胞产生TNF-a［19］，另一方面通过激活炎症小体NLRP3，产生IL-1p［0］。炎症反应可受30多种潜在机制的调节,PPAR y作为AS的保护因子，其抗炎作用早已得到证实，研究显示PPAR y通过调节TNF-a、IL-1、IL-6、细胞间黏附分子-1（ICAM-1/、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1/等因子改善内皮功能，从而发挥抗AS的作用［1］。Yao等［22］研究指出,PPAR y可诱导巨噬细胞分化为M2抗炎表型，从而改善了细胞炎症状态，起到抑制斑块形成，维持斑块稳定性的作用。PPAR y的作用受翻译后修饰的调节，如磷酸化、乙酰化、泛素化等，不同的生物学修饰可发挥不同功能，其中PPAR7Ser273磷酸化主要参与肥胖相关胰岛素抵抗相关机制，本课题组前期研究证实,ppar7部分激动剂替米沙坦通过降低PPAR7Ser273磷酸化来改变脂联素、瘦素、FABP4、GLUT
4和CAP的表达，促进脂联素分泌，从而增加胰岛素敏感性［3］。另有研究表明脂肪细胞中的PPAR7Ser273磷酸化可诱导TNF-a、IL-1p等炎症因子表达皿，因此我们推测在巨噬细胞中，PPAR7Ser273磷酸化也可能具有相同作用。本研究发现,ox-LDL刺激后，PPARySer273磷酸化水平增加，同时炎症因子释放增加，提示PPARySer273磷酸化可能巨噬应。为验证其作用，我们将PPAR7Ser273位点进行突变，并以WT型PPAR y作为对照，检测细胞中炎症因子分泌和表达水平，结果显示PPAR7Ser273位点突变后该位点不再检测出磷酸化水平，且随着磷酸化水平的消失，两种促炎因子的分泌和表达水平也下降，验证了PPAR7Ser273磷酸化对巨噬细胞炎症因子的促作用。
总之,PPAR7Ser273磷酸化促进了ox-LDL诱导
的巨噬细胞炎症反应，进一步加速了AS进程。
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(收稿日期：2020-02-05)
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