[收稿日期]㊀2019-12-16
[修回日期]㊀2020-03-03
[基金项目]㊀河南省医学科技攻关计划联合共建项目(LHGJ20190983)
[作者简介]㊀王玉香，硕士，主治医师，主要从事脑血管疾病及阿尔茨海默病的研究,E-mail 为1708616835@qq㊂通信作者李艾帆，博士，主任医师，主要从事脑血管病的基础与临床研究,E-mail 为liaifangnm@163㊂
㊃实验研究㊃
[文章编号]㊀1007-3949(2021)29-01-0054-06
沉默MAP4K4通过调控PPARγ/ABCA1通路缓解
ox-LDL 诱导的血管内皮细胞损伤
王玉香，燕燕，李永芳，李艾帆，李彦玲
(郑州市第一人民医院神经内科，河南省郑州市450004)
[关键词]㊀动脉粥样硬化;㊀内皮细胞;㊀MAP4K4;㊀氧化应激;㊀凋亡
[摘㊀要]㊀目的㊀探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAP4K4)在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL )诱导的血管内皮细胞损伤中的作用及其机制㊂方法㊀采用100mg /L ox-LDL 诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC )建立细胞损伤模型㊂RT-PCR 检测HUVEC 中MAP4K4的mRNA 表达水平㊂Western blot 法测定MAP4K4㊁Bax ㊁Bcl-2㊁Cleaved Caspase-3(C-Caspase-3)㊁过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)蛋白表达量㊂
CCK8法检测细胞存活率㊂ELISA 试剂盒检测细胞凋亡㊂DCFH-DA 用于检测细胞活性氧(ROS )水平㊂丙二醛(MDA )含量㊁超氧化物歧化酶(SOD )和过氧化氢酶(CAT )活性分别用其试剂盒进行检测㊂结果㊀ox-LDL 能明显上调MAP4K4的表达㊂另外，沉默MAP4K4能够显著增加细胞活性，且抑制ox-LDL 诱导的细胞凋亡；同时可抑制Bax 和C-Caspase-3的蛋白表达并促进Bcl-2的蛋白表达量㊂此外，下调MAP4K4能够明显抑制ROS 生成及MDA 含量，并增加抗氧化酶SOD 和CAT 活性㊂机制研究显示沉默MAP4K4能够激活PPARγ/ABCA1信号通路㊂结论㊀沉默MAP4K4通过激活PPARγ/ABCA1信号通路抑制ox-LDL 诱导的HUVEC 细胞凋亡和氧化应激从而减轻血管内皮细胞损伤，为As 提供理论依据㊂[中图分类号]㊀R541
[文献标识码]㊀A
Silencing of MAP 4K 4alleviated ox-LDL-induced vascular endothelial cell injury via regulating PPARγ/ABCA 1signaling
WANG Yuxiang,YAN Yan,LI Yongfang,LI Aifan,LI Yanling
(Department of Neurology ,the First People  s Hospital of Zhengzhou ,Zhengzhou ,Henan 450004,China )[KEY WORDS ]㊀atherosclerosis;㊀endothelial cell;㊀MAP4K4;㊀oxidative stress;㊀apoptosis
[ABSTRACT ]㊀㊀Aim ㊀The purpose of the present study was to investigate the potential role and mechanism of mitogen activated protein kinase kinase kinase kinase 4(MAP4K4)in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)injury in-duced by oxidized low density lipoprotein (ox-LDL).㊀㊀Methods ㊀The cell injury model was induced by ox-LDL (100mg /L).㊀The mRNA expression of MAP4K4was detected using RT-PCR assay.㊀Western blot analysis was conducted to estimate the protein levels of MAP4K4,Bax,Bcl-2,C-Caspase-3,peroxisome proliferators-activated receptorγ(PPARγ)and ATP binding cassette transporter A1(ABCA1).㊀CCK8assay was performed to measure cell viability.㊀ELISA assay was applied to analyse cell apoptosis.㊀The reactive oxygen species (ROS)production was measured by DCFH-DA assay.
The content of malondialdehyde(MDA)and the activity of superoxide dismutase (SOD)and catalase (CAT)were detected by commercially available assay kits.㊀㊀Results ㊀The expression of MAP4K4was elevated in ox-LDL-stimulated HU-VEC.㊀In addition,silencing of MAP4K4apparently enhanced cell viability and attenuated HUVEC apoptosis induced by ox-LDL accompanied by a decrease in the expression of Bax and C-Caspase-3and an increase in the expression of Bcl-2.㊀Moreover,MAP4K4knockdown remarkably alleviated the generation of ROS and the content of MDA accompanied with the enhanced activity of anti-oxidative enzyme system SOD and CAT triggerd by ox-LDL.㊀Mechanically,ablation of MAP4K4obviously activated PPARγ/ABCA1signaling pathway.㊀㊀Conclusion ㊀Depletion of MAP4K4relieves ox-LDL-induced
vascular endothelial injury by reducing apoptosis and mitigating oxidative damage via PPARγ/ABCA1activation,thus pro-viding the basis for the therapeutic effect of MAP4K4on the As.
㊀㊀动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是引发脑梗死的关键原因，其中最为重要的是颈动脉粥样硬化㊂当颈动脉粥样硬化不稳定斑块脱落或不断的扩大可阻塞血管，进而减少颈动脉相应供血区域血液的供应，从而造成短暂性脑缺血及脑梗死㊂氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)是一种促As发生因子，在As发生时其生成增加，能够损伤血管内皮细胞[1]㊂越来越多的报道表明血管内皮细胞损伤及功能改变是As发生发展的始动环节[2]，而血管壁内沉积的ox-LDL是血管内皮细胞凋亡的诱
导因子㊂ox-LDL诱导的氧化应激是引起内皮细胞损伤的主要原因之一[3]㊂ox-LDL可通过诱导细胞内氧化应激和内质网应激导致内皮细胞凋亡[2,4]㊂因此，抑制ox-LDL介导的内皮损伤有望成为预防或缓解As进展的有效措施㊂
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase kinase kinase kinase4,MAP4K4)是丝/苏氨酸激酶亚家族STE20/MAP4K中的一员，属于MAPK 信号通路的上游激酶㊂MAP4K4在免疫调节㊁炎症反应㊁代谢疾病㊁心血管疾病等生理及病理进程中发挥着非常重要的作用㊂有研究报道MAP4K4在小鼠和人类的ECs和As斑块中大量表达[5]，且MAP4K4能够增强内皮细胞通透性，促进炎症和As 的发生[5-6]㊂本研究拟通过ox-LDL刺激人脐静脉内皮细胞(HUVEC)建立体外细胞损伤模型，探讨MAP4K4在ox-LDL处理后的血管内皮细胞凋亡及氧化应激中的作用，以明确MAP4K4在ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤中的作用机制，以期为As的预防及提供新靶标㊂
1㊀材料和方法
1.1㊀材料
人脐静脉血管内皮细胞HUVEC(ATCC，美国);DMEM培养基以及胎牛血清(Gibco公司，美国);TRIzol试剂(Invitrogen公司，美国);SYBR Green Master荧光定量PCR试剂及细胞凋亡检测试剂盒(Cell Death Detection ELISA Kit)(Roche公司，美国);Prime Script反转录试剂(TaKaRa公司，日本);PVDF膜和ECL发
光液(Millipore公司，美国); BCA蛋白定量试剂盒(Thermo公司，美国);anti-MAP4K4抗体㊁anti-Bcl-2抗体㊁anti-Bax抗体㊁anti-ABCA1抗体和anti-GAPDH抗体(Abcam公司，美国)及anti-C-Caspase-3抗体和anti-PPARγ抗体(Santa Cruz公司，美国);MTT试剂盒(Sigma公司，美国);ROS试剂盒(上海碧云天公司)；丙二醛(MDA)测试盒㊁超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒和过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)㊂
1.2㊀细胞培养
将HUVEC培养在含有10%胎牛血清的DMEM 培养基中，置于37ħ㊁5%CO2的培养箱中㊂2~3天换液一次，当细胞融合度至80%左右时常规传代㊂
1.3㊀细胞转染和处理
按照Lipofectamine2000转染试剂说明书，分别将MAP4K4siRNA和阴性对照(negative control, NC)转染到HUVEC㊂MAP4K4siRNA序列为5ᶄ-CAG UCG CGU UUG CGA CUG G-3ᶄ,siRNA阴性对照序列为5ᶄ-GAC CAA CUC UGG CUU GUU A-3ᶄ㊂转染24h后，再用100mg/L ox-LDL处理24h㊂分别用RT-PCR和Western blot测定细胞中MAP4K4水平以评估转染效率㊂
1.4㊀RT-PCR检测目标mRNA表达量
用TRIzol试剂提取细胞总RNA，参照说明书进行操作，并检测浓度㊂将RNA反转录合成cDNA，操作步骤参照Prime-Script反转录试剂盒说明书㊂采用SYBR Green Master荧光定量PCR试剂在7900HT荧光定量PCR仪上进行反应，以检测目的基因的相对表达水平㊂MAP4K4的引物序列为F: 5ᶄ-GGG GAA CGC TTC AGA GTG AG-3ᶄ;R:5ᶄ-GTG CGG TCA GAT CAG CAG G-3ᶄ㊂GAPDH的引物序列为F:5ᶄ-ATG TTC GTC ATG GGT GTG AA-3ᶄ;R: 5ᶄ-GGT GCT AAG CAG TTG GTG GT-3ᶄ㊂PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成㊂
1.5㊀Western blot检测蛋白表达水平
收集各组细胞，按照试剂盒说明书步骤提取各组细胞总蛋白，使用BCA方法测定蛋白浓度㊂经SDS-PAGE电泳，然后电转到PVDF膜上，经过5%脱脂奶粉室温封闭2h，加入MAP4K4㊁Bax㊁Bcl-2㊁C-Caspase-3㊁PPARγ㊁ABCA1和GAPDH抗体4ħ孵育过夜,TBST洗膜，加入HRP标记的二抗室温孵育2h, TBST洗膜,ECL发光液曝光显影，并拍照，用Image J软件分析目的条带灰度值㊂以GAPDH作为内参㊂
1.6㊀MTT 检测细胞存活率
将处于对数生长期的HUVEC (5ˑ104个/mL )均
匀接种到96孔板中，放置于细胞培养箱中孵育，每孔加5g /L MTT 试剂20μL ，置于37ħ㊁5%CO 2培养
箱中孵育4h ，离心去除上清液㊂每孔加入150μL DMSO ,37ħ培养箱中孵育30min ，震荡使得充分溶解结晶物，用酶标仪检测各孔在490nm 处的吸光度值㊂
1.7㊀ELISA 检测细胞凋亡将细胞以5ˑ104个/mL 接种至6孔板中，按试
验设计各组进行处理后，用ELISA 检测试剂盒检测细胞凋亡，具体操作步骤参照试剂盒说明书㊂
1.8㊀ROS 含量测定
ROS 水平运用活性氧检测试剂盒，操作步骤参
照试剂盒说明说进行㊂将DCFH-DA 用无血清培养液稀释至10μmol /L ㊂收集各组细胞，然后每孔加入稀释后的DCFH-DA 避光孵育30min ,PBS 洗涤3次后，用流式细胞仪细胞内ROS 含量㊂
1.9㊀抗氧化指标MDA 、SOD 和CAT 的检测收集各组细胞上清液，严格按试剂盒说明书方
法，检测细胞内MDA 含量及SOD 和CAT 的活性㊂
ox
1.10㊀统计学分析
采用SPSS 21.0以及GraphPad Prism 7软件对
所有数据进行统计分析，计量数据以x ʃs 表示㊂两组间比较采用t 检验，多组间比较采用One-way ANOVA ㊂P <0.05为差异有统计学意义㊂
2㊀结㊀果
2.1㊀Ox-LDL 上调人脐静脉内皮细胞MAP4K4的
表达
采用100mg /L ox-LDL 处理HUVEC 24h 后，运用RT-PCR 和Western blot 检测HUVEC 中MAP4K4mRNA 和蛋白的表达水平㊂结果显示,ox-LDL 能显著上调HUVEC 中MAP4K4mRNA 的表达量(图
1A)㊂Western blot 结果也显示细胞中MAP4K4蛋白的表达趋势和mRNA 变化一致(图1B)㊂为进一步探讨MAP4K4对ox-LDL 诱导的内皮损伤的影响，通过转染shMAP4K4后细胞中MAP4K4的表达显著降低(图
1)㊂
图1.Ox-LDL 对人脐静脉内皮细胞中MAP4K4表达的影响(n =3)
A 为RT-PCR 检测MAP4K4mRNA 表达水平㊂
B 为Western blot 检测MAP4K4蛋白表达量㊂
a 为P <0.05，与阴性对照组比较;
b 为P <0.05，与ox-LDL 组比较㊂
Figure 1.Effects of ox-LDL on MAP4K4expression in human umbilical vein endothelial cell (n =3)
2.2㊀MAP4K4沉默抑制ox-LDL 诱导的HUVEC 凋亡
Ox-LDL 诱导的氧化应激通常伴随着细胞凋亡,
因此探讨MAP4K4对ox-LDL 诱导的HUVEC 凋亡的影响㊂MTT 结果显示，与阴性对照组比较,ox-
LDL 组细胞存活率呈降低趋势,MAP4K4沉默明显增加细胞存活率(图2A,P <0.05)㊂ELISA 结果显示，与阴性对照组比较,ox-LDL 组细胞凋亡率明显
增加，而MAP4K4沉默后细胞凋亡率降低(图2B;P
<0.05)㊂Western blot 检测发现，与阴性对照组比
较,ox-LDL 组Bcl-2/Bax 明显降低，且C-Caspase-3表达明显上调(P <0.05)；与ox-LDL 组比较,MAP4K4沉默后Bcl-2/Bax 升高，而C-Caspase-3表达量下降(图2C ~E;P <0.05)㊂上述结果提示沉默MAP4K4对ox-LDL 诱导的HUVEC 凋亡具有明显的抑制
作用㊂
图2.MAP4K4对ox-LDL 诱导的HUVEC 凋亡的影响(n =3)
A 为MTT 检测细胞存活率;
B 为ELISA 测定细胞凋亡率;
C ~F 为Western blot 检测凋亡相关蛋白Bcl-2㊁Bax 和
C-Caspase-3的表达量㊂a 为P <0.05，与阴性对照组比较;b 为P <0.05，与ox-LDL 组比较㊂
Figure 2.Effects of MAP4K4on ox-LDL-induced apoptosis in HUVEC (n =3)
2.3㊀MAP4K4沉默抑制ox-LDL 诱导的HUVEC 氧化应激损伤
Ox-LDL 能够通过诱导氧化应激反应从而导致
内皮细胞损伤，因此，进一步探讨MAP4K4对ox-LDL 刺激HUVEC 氧化应激水平的影响㊂与阴性对照组比较,ox-LDL 组ROS 显著增加，而MAP4K4沉默可抑制ox-LDL 诱导的ROS 水平(均P <0.05)㊂
与阴性对照组比较,ox-LDL 组细胞MDA 水平明显增加，而SOD 和CAT 水平明显下降(均P <0.05)㊂与ox-LDL 组比较,MAP4K4沉默后MDA 水平明显下降,SOD 和CAT 水平明显增加(均P <0.05)，上述结果提示MAP4K4可减缓ox-LDL 对血管内皮细胞氧化损伤(图
3)㊂
图3.MAP4K4对ox-LDL 诱导的HUVEC 氧化应激的影响(n =3)
A 为采用DCFH-DA 检测ROS 的含量；试剂盒检测MDA 含量(B)及SOD(C)和CAT(D)活性㊂
a 为P <0.05，与阴性对照组比较;
b 为P <0.05，与ox-LDL 组比较㊂
Figure 3.Effects of MAP4K4on ox-LDL-induced oxidative stress in HUVEC (n =3)
2.4㊀MAP4K4沉默能够激活PPARγ/ABCA1信号通路
进而探讨MAP4K4对内皮细胞氧化应激和凋
亡的调控机制㊂应用Western blot 方法检测PPARγ和ABCA1蛋白的表达变化㊂结果显示MAP4K4沉默后,PPARγ和ABCA1的蛋白水平显著升高，提示沉
默MAP4K4能够激活ox-LDL 处理的HUVEC PPARγ/ABCA1信号通路(图4)，表明MALAT1通过调控
PPARγ/ABCA1通路从而调节内皮细胞凋亡和氧化应激损伤
㊂
图4.MAP4K4对PPARγ/ABCA1信号通路的影响(n =3)
Western blot 测定PPARγ和ABCA1的蛋白表达量㊂a 为P <0.05，与阴性对照组比较;b 为P <0.05，与ox-LDL 组比较㊂
Figure 4.Effects of MAP4K4on PPARγ/ABCA1signaling (n =3)
3㊀讨㊀论
As 在脑梗死的发病中有着至关重要的作用，其
中颈动脉粥样硬化与脑梗死的发生更为密切㊂血管内皮细胞损伤在As 的发生发展中起到重要促进作用[7]㊂当内皮细胞处于正常生理状态下，细胞增殖和凋亡维持平衡，从而使得血管发挥正常功能[8]㊂当As 发生时,ox-LDL 等因素会刺激血管内皮细胞，使得细胞发生异常凋亡及氧化应激等反应，从而破坏了血管组织，最终导致血管功能失常㊂有研究证实，内皮细胞的过度凋亡是内皮功能障碍的始动发病机制[9]，在As 发生和发展中起重要作用，而抑制内皮细胞凋亡和保持内皮细胞活性有望成为预防和As 的重要措施㊂本研究结果显示,ox-LDL 刺激后细胞活力明显降低，而敲减MAP4K4后细胞活力有所增加，揭示沉默MAP4K4可缓解ox-LDL 刺激导致的细胞损伤㊂另外,ox-LDL 刺激诱导细胞凋亡，与此同时Bax 和C-Caspase-3的表达增加,Bcl-2的表达下降；而沉默MAP4K4可抑制ox-LDL 诱导凋亡，且降低Bax 和Caspase-3的表达，并促进Bcl-2表达，由此表明敲减MAP4K4对ox-LDL 引起的细胞损伤具有保护作用的重要机制㊂氧化应激是引发As 内皮细胞损伤的关键机
制[10-11]㊂ox-LDL 刺激使得血管内皮细胞中抗氧化酶SOD 活性降低，导致细胞内ROS 不能够及时被清除，而且ROS 能够激活细胞中Caspase 凋亡反应，从而引发细胞凋亡[12-13]㊂本研究发现ox-LDL 刺激
HUVEC 后,ROS 水平及MDA 含量升高，且SOD 和CAT 活性有所降低，说明ox-LDL 造成血管内皮细胞
功能损伤，而MAP4K4沉默后抑制ROS 的生成及MDA 含量，且SOD 和CAT 活性升高，说明下调MAP4K4能够保护HUVEC 抵抗ox-LDL 诱导的氧化应激损伤㊂
有研究表明，在As 病变中三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP bindingcassette transporter A1,ABCA1)表达降低，这种降低与炎症反应增强和动脉粥样硬化进展有关[14]㊂另有研究报道ABCA1通过促进胆固醇外排和抑制炎症抑制动脉粥样硬化发生[15]㊂ABCA1在调节胆固醇外流㊁抗炎及内皮保护中发挥重要作用[16]㊂有研究发现载脂蛋白AI 拟肽5A 不仅对ABCA1介导的胆固醇外排高度特异性，而且通过与ABCA1相互作用保护内皮细胞免受急性炎症和氧化应激的影响[17]㊂此外，载脂蛋白AI 拟肽D-4F 通过PI3K /Akt /AMPK /eNOS /HO-1信号通路抑制ox-LDL 诱导的内皮细胞氧化应激㊁炎症反应㊁凋亡从而促进内皮修复，而ABCA1在此过程中发挥重要作用[18]，表明ABCA1具有抗炎㊁抗氧化应激及抗凋亡作用㊂多项研究证实,PPARγ促进ABCA1表达，并在胆固醇外排方面发挥了重要作用[19-20]㊂CUMS 促进As 的发生可能是通过HMGB1介导的PPARγ/LXRα-ABCA1信号通路[21]㊂此外,MAP4K4负调控PPARγ的表达[22]㊂本研究发现下调MAP4K4能够升高ox-LDL 处理的HUVEC 中PPARγ和ABCA1蛋白表达水平，表明能够激活PPARγ/ABCA1信号通路㊂由此推测,MAP4K4通过作用于PPARγ/ABCA1通路调控ox-LDL 介导的HUVEC 凋亡进程和氧化损伤㊂
总之,MAP4K4沉默可抑制ox-LDL 诱导的血管

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。