ox2LDL诱导内皮细胞损伤条件培养基及气血并治方有效组分配伍对平滑肌细胞MAPK、PKC活性和胞内C a2+荧光强度的影响3
嵇　波1　史大卓1　刘剑刚1　王永炎2
(1中国中医研究院西苑医院　北京100091)
(2中国中医研究院　北京100700)
ΞΞΞ
摘要：目的　观察氧化低密度脂蛋白(ox2LD L)诱导血管内皮细胞(VEC)损伤条件培养基及气血并治方有效组分D(主要为芍药苷)和E(主要为总黄酮)配伍(重量比1∶2)是否对血管平滑肌细胞(VS MC)MAPK、PK C活性和胞内Ca2+荧光强度有影响。方法　将VS MC正常培养液、ox2LD L诱导VEC损伤的条件培养基、辛伐他汀加ox2LD L诱导VEC损伤的条件培养基、有效组分D和E优化配伍加ox2LD L诱导VEC损伤的条件培养基等分别作用于VS MC，采用β2放射活性法测定丝裂素活化蛋白激酶(mitogen2activated protein kinase,MAPK)及蛋白激酶C(protein kinase C,PK C)活性，流式细胞仪检测VS MC内的Ca2+荧光强度。结果　VEC损伤条件培养基作用于VS MC后，与正常培养VS MC相比，细胞MAPK、PK C活性明显增加(P<0101)，细胞内Ca2+荧光强度增加；有效组分D和E 配伍作用于VEC损伤条件培养基培养的VS MC后，
与模型组相比,MAPK及PK C活性明显减少(P <0101)、细胞内Ca2+荧光强度降低。结论　气血并治方中有效组分D和E优化配伍可以拮抗MAPK、PK C活性和细胞内Ca2+荧光强度的增加，气血并治方防治动脉粥样硬化(AS)的作用可能与此有关。
关键词：动脉粥样硬化；内皮细胞；平滑肌细胞；氧化低密度脂蛋白；气血并治方
中图分类号:R28515
血管内皮细胞(vascular end othelial cells,VE C)损伤是动脉粥样硬化(ather oscler osis,AS)形成的始动环节[1]。病理状态下,VE C的屏障功能和分泌功能均发生改变，不仅可使血液循环中的活性物质直接地作用于血管平滑肌细胞(vascular sm ooth muscle cells,VS MC)，而且还可大量合成和分泌多种生长因子和生物活性因子，使VS MC表型发生转变(由收缩表型转变为合成表型)，并刺激VS MC迁移增殖，促进AS的发生和发展[2]。新近有研究联胺(diam ide)损伤VE C，采用3H2T dR掺入法观察VE C损伤条件培养基对VS MC增殖活性的影响，结果证明VE C损伤条件培养基确实能明显促VS MC增殖[3]。VS MC信号转导机制及调控的研究为目前防治AS研究领域的热点。VE C损伤条件培养基对VS MC信号转导通路影响尚未见报道。气血并治方由活血化瘀名方“血府逐瘀方”化裁而来，方由川芎、赤芍、桃仁、红花、柴胡、枳壳组成，具有理气活血之功效。我们以前的研究[4]发现ox2LD L诱导VE C损伤条件培养基能明显促进体外培养的VS MC增殖，由气血并治方提取的有效组分D(主要为芍药苷)和E(主要为总黄酮)配伍能
明显抑制条件培养基诱导VS MC增殖。为了进一步探讨有效组分D和E配伍抑制VS MC增殖的机理，在原实验基础上，观察有效组分D和E配伍对ox2LD L诱导VE C损伤的条件培养基引起VS MC信号转导通路中平滑肌细胞丝裂素活化蛋白激酶(M APK)、蛋白激酶C(PK C)和胞内C a2+变化的影响。
1　材料及方法
111　ox2LD L诱导内皮细胞损伤条件培养和鉴定制备ox2LD L，人脐静脉内皮细胞、大鼠胸主动脉平滑肌细胞培养和鉴定，方法见参考文献[4]。112　血管内皮细胞损伤条件培养基的制备
第2代H U VE C以2×105个/孔密度接种于6孔细胞培养板(2m L/孔)中，贴壁后换以含2%F BS M199培养液培养6h，再换以终浓度为100m g/L ox2LD L继续培养VE C24h，收集上清液，以直径为0122μm微孔滤膜过滤后制备条件培养基,-20℃保存备用。
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2
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第28卷第2期2005年3月V ol.28N o.2Mar.2005 
北京中医药大学学报
Journal of Beijing University of T raditional Chinese Medicine
Ξ
ΞΞ国家重点基础研究发展规划项目(N o1G199905445205)嵇　波，女,39岁，医学博士，主治医师
113　流式细胞仪检测血管平滑肌细胞内Ca 2+荧光
强度
  实验分为6组:A 组，正常培养液组;B 组，血管内皮细胞损伤条件培养基(endothelial cell conditioned medium ,EC 2C M );C 组,EC 2C M 加辛伐他汀(终浓度为1mm ol/L );D 组,EC 2C M 加D 和E 配伍(终浓度为10mg/L );E 组,EC 2C M 加D 和E 配伍(终浓度为1mg/L );F 组,EC 2C M 加D 和E 配伍(终浓度为011mg/L )。取各组培养液作用于第5代VS MC 48h ，弃培养液，用P BS 洗2次，用01125%胰蛋白酶
和0102%E DT A 2Na 2等量混合的消化液进行消化,
收集细胞至E p 管，用4℃P BS 洗涤2次，离心弃上清，制成细胞悬液,5×105L -1,012m L 细胞悬液加入1μL Fluo 23染液，置37℃避光45min 。P BS 洗涤2次，加入013m L P BS 重悬。300目尼龙网过滤，上机检测。114　血管平滑肌细胞MAPK 活性测定
取经过条件培养液及药物处理1h 的VS MC ，弃培养液，用冷P BS 洗3次，用01125%胰蛋白酶和0102%E DT A 2Na 2等量混合的消化液进行消化，收集细胞至E p 管,4000r/min 离心5min ，弃上清。加入5倍体积的细胞裂解液，置于冰上30min 后，超声破碎细胞5s ,4℃13000r/min 离心10min ，取上清用于MAPK 活性测定及蛋白定量[5]。取上述上清液50μL ，考马斯亮蓝法进行蛋白定量(反应体系中蛋白质含量要达到50～200μg )，加入羊抗2MAPK 抗体每100pg 蛋白5pg 抗体,015m L ,4℃振摇孵育4h ，生成的免疫复合物进一步与抗2小鼠IgG 2琼脂糖珠共孵育(4℃,30min )，随后用裂解缓冲液冲洗6次，取免疫复合物与含髓磷脂碱性蛋白(M BP ,1g/L )的
激酶缓冲液100μL 共孵育15min (30℃
)后，置冰浴终止反应，取80μL 反应液点于P81Phosphocellulose 滤纸(Whatman )上,015%磷酸缓冲液洗净，自然干燥后置于液闪瓶中，加闪烁液过夜,β2液闪仪测定
M BP 中32P 的掺入量，以样品和空白32P 掺入量的差值表示MAPK 活性，单位为nm ol/(g ・min )。115　血管平滑肌细胞PK C 活性测定
取经过条件培养液及药物处理1h 的大鼠胸主动脉平滑肌细胞，弃培养液，细胞以4℃P BS 洗3次，悬浮于穿细胞液中(反应终体积150μL ),37℃孵育10m in 后，加入r 232P 2A TP (37k Bq/管)启动反应，孵育10m in 后加入冷终止液100μL 终止反应[6]。冰浴10m in 后离心(3000r/m in ,15m in )，取上清液120μL 点于P81ph os 2ph ocellulose 滤纸上，晾干后以洗脱液洗2次，再以无水乙醇洗1次，干燥后加入闪烁液，以β液闪仪测定放射活性(cpm/3×105个细胞)。同时作不加PK C 底物肽的对照检测，实验管与对照管的差值表示PK C 的活性，单位为nm ol/(g ・m in )。116　统计学分析
数据以(x ±s )表示。应用SPSS1010软件包，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用q 检验。2　结果211　ox 2LD L 损伤VEC 条件培养基及有效组分D 和E 配伍对VS MC 内Ca 2+荧光强度的影响  结果见图1。VS MC 经ox 2LD L 诱导VEC 损伤条
件培养基作用后(图B )，细胞内Ca 2+荧光强度比正常对照组(图A )增强;VS MC 经ox 2LD L 诱导VEC 损伤条件培养基加有效组分D 和E 配伍(终浓度分别为10、1、011mg/L )作用后，细胞内Ca 2+荧光强度，比EC 2C M 组减弱，而且有效组分D 和E 配伍(1mg/L )组与阳辛伐他汀组细胞内Ca 2+荧光强度相似。212　ox 2LD L 损伤VEC 条件培养基及有效组分D 和E 配伍对平滑肌细胞MAPK 和PK C 活性的影响  ox 2LD L 诱导VEC 损伤条件培养基可增加VS MC 内MAPK 和PK C 活性，而气血并治方中有效组分D 和E 配伍可拮抗条件培养基诱导VS MC MAPK 、PK C 活性的增加。结果见表1。
表1　气血并治方有效组分D 、E 配伍对血管平滑肌细胞MAPK 和PK C 活性的影响(n =4；珔x ±s )
组别
M APK 活性/nm ol/(g ・min )
PK C 活性/nm ol/(g ・min )正常组
    60180±3110
161194±13193条件培养基组
359104±9184△△817114±19119##条件培养基+辛伐他汀/1m ol/L 64176±614033186127±419133条件培养基+D 和E 配伍/011mg/L 269169±810733702160±23161条件培养基+D 和E 配伍/1mg/L 180109±1216233　267168±116533条件培养基+D 和E 配伍/10mg/L
67133±813933　
217136±2812733
  注：与正常组比较　△△P <0101；与条件培养基组比较3P <010533P <0101
・03・北京中医药大学学报                　第28卷
A正常组　B条件培养基组　C条件培养基+辛伐他汀组(1m ol/L)　D条件培养基+D和E配伍(011mg/L)　E条件培养基+D和E配伍(1mg/L)　F条件培养基+D和E配伍(10mg/L)图1　气血并治方有效组D、E配伍对血管平滑肌细胞内C a2a荧光强度的影响
3　讨论
动脉粥样硬化是严重危害人类生命健康的多发病和常见病。血管平滑肌细胞增殖是AS形成和发展的关键病理改变之一。抑制VS MC的增殖是防治AS形成和发展的重要环节，因而拮抗VS MC增殖的药物研究已成为防治AS引起的心血管疾病的国内外研究热点[7]。
VS MC增殖机制是一个复杂的网络系统，涉及血管周围生长因子和生物活性因子的产生和释放、信号转导通路的级联反应、原癌基因表达调控及细胞周期等方面的变化。近年来在研究VS MC增殖信号转导通路方面取得了许多成果。目前研究较多的与细胞增殖相关的信号转导途径主要包括如下几条：丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路；磷脂酶C2蛋白激酶C(PK C)通路;Src2FAK通路;JAK/ST AT途径等。PK C和MAPK在VS MC增殖调控中起重要作用[8]。平滑肌细胞膜上受体经受体激动剂激活后，由P LC催化的磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidyli2 nositol24,52bisphosphate,PIP2)水解为1,4,52三磷酸肌醇(inositol21,4,5trisphosphate,IP3)和二酰基甘油(DG)，使细胞外信号转化为细胞内信号。IP3浓度增加后，可作用于内质网上的IP3受体，使内质网储存的Ca2+释放,DG作为第二信使，在Ca2+存在下激活PK
C。PK C静息时主要存在于胞浆部分，当PK C 激活时，会发生浆膜转位，通过催化多种靶蛋白发生磷酸化反应，完成细胞对外源性信号的应答。MAPK 系统是细胞外生物信号引起细胞增殖、分化等核反应的共同途径或汇聚点，其在生长因子刺激VS MC 增殖中起十分重要的作用[9,10]。以往研究表明，许多增殖信号和抑制因子通过其受体或其他跨膜途径，激活或抑制细胞内蛋白激酶如PK C，通过相应因子介导，最终激活或抑制MAPK。活性的MAPK可以通过使一些转录因子磷酸化，从而使增殖信号传递到核内，启动原癌基因(c2myc、c2fos、c2jun、)表达，诱导VS MC增殖。
我们曾在体外培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞水平，进行气血并治方有效组分D和E配伍的细胞药物毒性实验，结果显示:VS MC经D和E配伍(浓度范围为0101～200mg/L)作用48h，其形态及MTT染法测定的OD值与正常培养液组无明显差别。本实验在此基础上，以放射活性和流式细胞仪检测方法，观察ox2LD L诱导VEC损伤条件培养基组PK C、M APK活性明显高于正常对照组,Ca2+荧光强度高于正常对照组。气血并治方中有效组分D和E配伍能有效拮抗VEC损伤条件培养基刺激平滑肌细胞内PK C、M APK活性增加，降低细胞内Ca2+浓度。说明
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嵇　波等　ox2LD L诱导内皮细胞损伤条件培养基及气血并治方有效组分第2期配伍对平滑肌细胞M APK、PK C活性和胞内Ca2+荧光强度的影响
磷脂酶C 2PK C 途径和M APK 途径介导了ox 2LD L 诱导
VEC 损伤条件培养基促VS MC 增殖效应。气血并治方有效组分D 和E 配伍抑制VEC 损伤条件培养基诱导VS MC 增殖效应与磷脂酶C 2PK C 途径、M APK 途径密切相关。其确切的机制尚有待于进一步的研究。
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4　嵇　波，刘剑钢，史大卓，等1气血并治方有效组分不同配伍
对血管内皮细胞损伤条件培养基诱导血管平滑肌细胞增殖的影响1北京中医药大学学报,2005,28(1):30～
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basic fibroblast growth factor 2induced proliferation through mito 2gen activated protein kinase in coronary sm ooth muscle cell.Ar 2terioscler Thromb Vasc Biol ,1999,19(7):1608～1614
(收稿日期:2004210221)
I nfluence of the conditional medium of the injured endothelial cells induced by ox 2LDL and the compatibility of effective components
extracted from Q ixue Bingzhi Formula on the activity of VSMC ,MAPK,PKC
and the fluorescent intensity of intracellular C a 2+
Ji Bo(嵇　波)1,Shi Dazhuo(史大卓)1,Liu Jiangang(刘剑刚)1,et al
(1Xi Yuan H ospital ,China Academy of T raditional Chinese Medicine ,B eijing 100091;)
(2China Academy of T raditional Chinese Medicine ,B eijing 100071)
Abstract :Objective  T o observe whether the conditional medium of the injured Vascular endothelial cel
ls (VEC )
induced by ox 2LD L ,the D (with majority of paeonioflorin )and E (with majority of total flav one )(weight ratio 1:2)com 2patibility of the effective com ponents extracted from Qixue Bingzhi F ormula have any influence on the activity of Vascular sm ooth muscle cells (VS MC ),MAPK,PK C and the fluorescent intensity of intracellular Ca 2+.Method  The VS MC normal culture fluid ,the conditional medium of the injured VEC induced by ox 2LD L ,the conditional medium of the in 2jured VEC induced by ox 2LD L and Simvastatin ,the conditional medium of the injured VEC induced by ox 2LD L and the D and E com patibility of the effective com ponents extracted from Qixue Bingzhi F ormula acted on the VS MC respectively.With β2radioactivity assay the activity of the mitogen 2activated protein kinase (MAPK )and protein kinase C (PK C )were assayed ,and with the Liquid Cellular T echnique the fluorescent intensity of intracellular Ca 2+of VS MC was assayed too.R esult  In com paris on with the normal cultured VS MC ,it has been found that conditional medium of the injured VEC acted on VS MC ,the activity of MAPK and PK C of VS MC significantly increased and the fluorescent intensity of intracel 2lular Ca 2+increased too ;whereas after the D and E com patibility of the effective com ponents acted on the cultured VS MC with the conditional medium of the injured VEC ,in com paris on with the m odel cultured VS MC ,the activity of MAPK and PK C significantly decreased (p <0.01),and t
he fluorescent intensity of intracellular Ca 2+lowered.Conclusion  The D and E com patibility of the effective com ponents from Qixue Bingzhi F ormula is able to inhibit the increase of the activity about MAPK and PK C ,and increase of the fluorescent intensity about intracellular Ca 2+.The action of Qixue Bingzhi F ormula in prevention and treatment of AS may be related to the paeonioflorin and total flav one (weight ratio 1:2)com 2patibility of the effective com ponents ,which can inhibit the activity of MAPK and PK C of VS MC induced by the condi 2tional medium of the injured VEC and the fluorescent intensity of intracellular Ca 2+.
K ey w ord :Atherosclerosis ;endothelial cells ;sm ooth muscle cells ;oxidized low 2density lipoprotein ;Qixue Bingzhi F ormula
・23・北京中医药大学学报                　第28卷

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