葛根素通过抑制ox-LDL诱导巨噬细胞焦亡通路活化稳定AS易损斑块①
章平衡李春燕刘永源王明刘锦鸿梁东辉②（南方医科大学珠江医院，广州510282）
中图分类号R593.22文献标志码A文章编号1000-484X（2021）18-2212-06
［摘要］目的：研究葛根素对ox-LDL诱导巨噬细胞NLRP3/Caspase-1焦亡信号通路的影响，探讨葛根素稳定动脉粥样硬化（AS）易损斑块的潜在调节机制。方法：采用佛波酯（PMA）刺激THP-1细胞48h，诱导其分化为巨噬细胞，分别给予ox-
LDL（100μg/ml）、低（100μg/ml）、中（250μg/ml）和高剂量葛根素（500μg/ml）。CCK-8法检测不同浓度葛根素对巨噬细胞存活率的影响。油红O染检测巨噬细胞内脂质聚集及其泡沫化情况；RT-qPCR检测炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β及IL-2 mRNA水平；Western blot检测细胞焦亡蛋白NLRP3、Caspase-1、cleaved-Caspase-1水平，细胞免疫荧光法测定NLRP3表达和定位。结果：高、中、低剂量葛根素对巨噬细胞存活率无明显影响（P>0.05），均可抑制脂质在巨噬细胞内沉积及泡沫化（P<0.01），下调炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-2mRNA水平（P<0.01），抑制细胞焦亡蛋白NLRP3、cleaved-Caspase-1表达（P<0.01），并呈剂量依赖性。结论：葛根素可能通过抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞NLRP3/Caspase-1焦亡信号通路活化，下调炎症细胞因子表达，稳定AS易损斑块。
［关键词］动脉粥样硬化；葛根素；巨噬细胞；焦亡
Puerarin inhibits ox-LDL induces macrophage pyrolytic pathway activation to stabilize AS vulnerable plaque
ZHANG Ping-Heng，LI Chun-Yan，LIU Yong-Yuan，WANG Ming，LIU Jin-Hong，LIANG Dong-Hui.Zhujiang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou510282，China
［Abstract］Objective：To investigate effect of puerarin on ox-LDL induced focal death signaling pathway NLRP3/Caspase-1of macrophages，and to explore potential regulatory mechanism of puerarin stabilizing atherosclerotic（AS）vulnerable plaque.Methods：THP-1cells were stimulated by phorbol ester（PMA）for48h to induce them differentiation into macrophages，and intervened by ox-LDL（100μg/ml），low dose（100μg/ml），medium dose（250μg/ml）and high dose puerarin（500μg/ml），respectively.Effects of different concentrations of puerarin on survival rate of macrophages were detected by CCK-8.Lipid aggregation and foaming in mac‐rophages were detected by oil red O staining.Inflammatory cytokine IL-6，TNF-α，IL-1βand IL-2mRNA levels were detected by RT-qPCR.Protein expressions of NLRP3，Caspase-1，cleaved-Caspase-1were detected by Western blot，protein expression and localiza‐tion of NLRP3were detected by cell immunofluorescence.Results：High，medium，low doses of puerarin had no significant effect on macrophage survival（P>0.05），and could inhibit lipid deposition and foamation in macrophages（P
<0.01），decrease levels of inflam‐matory cytokine IL-6，TNF-α，IL-1β，IL-2mRNA（P<0.01），and inhibit protein expressions of NLRP3，cleaved-Caspase-1（P< 0.01），which in a dose-dependent manner.Conclusion：Puerarin may stabilize AS vulnerable plaque by inhibiting ox-LDL-induced ac‐tivation of NLRP3/Caspase-1focal death signaling pathway forehead and down-regulating inflammatory cytokines expressions.
［Key words］Atherosclerosis；Puerarin；Macrophages；Pyroptosis
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）易损斑块是急性心血管疾病发生的重要病理基础。近年研究发现，细胞焦亡和炎症在AS易损斑块进展过程中起关键作用。巨噬细胞是AS易损斑块形成的重要推动者［1-2］。AS斑块中包含大量泡沫化的巨噬细胞，
在疾病发展过程中，胆固醇被巨噬细胞吞噬并在细胞中沉积，形成泡沫化细胞，同时促进巨噬细胞分泌大量炎症细胞因子，如IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，加重局部炎症反应，进而促进巨噬细胞焦亡，从而释放大量炎症细胞因子，如IL-1、IL-18等，加重AS易损斑块炎症反应，导致斑块进一步损伤和破裂，促进急性心血管疾病发生发展［3-5］。
目前，临床AS及稳定斑块的药物主要为他
doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2021.18.007
①本文为国家自然科学基金面上项目（81774036）。
②通信作者，E-mail：dhliang79@163。
作者简介：章平衡，女，博士，住院医师，主要从事中医药防治心血管及风湿疾病方面的研究。
·中医中药与免疫·
汀类药物，虽然可有效降低血脂水平，抑制脂蛋白和胆固醇合成和分泌，稳定易损斑块，但作用靶点单一，具有多种副作用，如肝功能受损、肌肉酸痛、皮疹等，临床应用受限，无法满足所有患者需求［4］。近年药理学研究发现，中药葛根的有效成分葛根素具有抗炎、调脂降压、保护心肌细胞、抗血小板聚集、调节免疫、增强心肌收缩力、扩张冠状动脉等功效［5-6］。新近研究表明，葛根素具有抗AS、降低AS炎症因子作用，但具体机制尚未阐明［7］。因此，本研究通过观察葛根素对体外ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫化的影响，以NLRP3介导的细胞焦亡信号通路为靶点，探讨葛根素稳定AS易损斑块、抗AS和预防急性心血管疾病的潜在分子机制，为临床稳定AS易损斑块和防治急性心血管疾病提供新思路和药物。
1材料与方法
ox
1.1材料
1.1.1主要试剂THP-1细胞购自广州吉妮欧生物科技有限公司；葛根素（C21H20O9，分子量416.38）购自北京索莱宝生物科技有限公司（0.1g）；RP‐
MI1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素购自美国Gibco公司；佛波酯（PMA）、氧化低密度脂蛋白（oxi-dized low density lipoprotein，ox-LDL）购自美国Sigma 公司；CCK-8试剂盒购自北京全式金公司；NLRP3（货号：SH-bs-10021R）、Caspase-1（货号：22915-1-AP）、cleaved-Caspase-1（货号：4199S）抗体购自美国Abcam公司；GAPDH购自武汉三鹰生物技术有限公司；DAB显液购自广州赛国生物公司；聚合HRP 标记IgG（抗鼠货号：RM3001，抗兔货号：RM3002）二抗购自武汉博士德公司；RIPA裂解液购自江苏凯基生物技术股份有限公司；细胞总RNA抽提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；逆转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。1.1.2主要仪器荧光显微镜购自日本Nikon公司；制冰机购自意大利Scotsman公司；恒温浴箱购自上海跃进医疗器械一厂；超纯水机购自美国Mil Upore公司；高皮灭菌锅购自英国Astell公司；离心机、移液、微量移液器购自德国Eppendorf公司；实时荧光定量PCR仪、−80℃冰箱购自德国Thermo公司；−20℃冰箱、4℃冰箱购自德国Siemens公司；细胞CO2培养箱购自美国Thermo Scientific公司；核酸微量分光光度计购自美国NanoVue公司；电泳仪购自美国Bio-Rad公司；超净工作台购自苏州安泰。1.2方法
1.2.1细胞培养及分组采用RPMI1640培养液（含5%胎牛血清、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素）培养THP-1细胞，取对数生长期细胞以1×106个/孔接种于6孔板，加入PMA，37℃、5%CO2培养48h诱导巨
噬细胞，进行后续实验。实验分为5组：对照组（仅加入RPMI1640培养液）、ox-LDL组（加入RP‐
MI1640培养液和100μg/ml ox-LDL）、葛根素低、中、高剂量组［加入RPMI1640培养液和100μg/ml ox-LDL的同时分别加入100、250、500μg/ml葛根素（CCK-8实验确定）］，培养48h后进行后续实验。1.2.2CCK-8法检测细胞存活率将处理好的巨噬细胞以1×105个/孔接种于96孔板，培养24h，分别加入100μg/ml ox-LDL及葛根素（50、100、250、500、1000μg/ml），各组设3个复孔。对照组仅加入100μg/ml ox-LDL，培养48h，分别加入CCK-8试剂（10μl/孔），避光混匀，放置4h，采用酶标仪检测波长490nm处OD值，确定葛根素有效的高、中、低剂量进行后续实验。
1.2.3油红O染将巨噬细胞以1×105个/孔接种于24孔板，分别采用100μg/ml ox-LDL和高、中、低剂量葛根素进行处理，培养48h，弃培养基，4%多聚甲醛固定10min，蒸馏水洗涤2次，60%异丙醇浸泡5min，加入新配制的油红O染液浸染30min，弃染液，蒸馏水洗涤3次。加入苏木染液复染细胞核1~2min，弃染液，清洗3次，油镜下观察脂质情况，300μl异丙醇（1000ml/L）脱10min，520nm 处测定吸光度（A）值进行脂质定量。
1.2.4RT-qPCR检测巨噬细胞中细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-αmRNA水平收集处理后的各组巨噬细胞，按说明书提取巨噬细胞总RNA，采用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，实时荧光定量PCR进行目的基因扩增。PCR扩增体系：2×TB Green10.0μl，引物各0.4μl（引物序列见表1），50×ROX Refere
nceDyeⅡ0.4μl，cDNA2μl，ddH2O 7.2μl，总体系20μl。反应条件：95℃预变性30s，表1引物序列
Tab.1Primer sequences
Primer
IL-1β
IL-2
IL-6
TNF-α
GAPDH
Sequence
F：5'-ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA-3'
R：3'-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-5'
F：5'-AACTCCTGTCTTGCATTGCAC-3'
R：3'-GCTCCAGTTGTAGCTGTGTTT-5'
F：5'-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3'
R：3'-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-5'
F：5'-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3'
R：3'-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-5'
F：5'-AACGGATTTGGTCGTATTG-3'
R：3'-TAGTGGTAGAAGGTCCTCCG-5'
Length（bp）
132
93
172
220
214
95℃退火5s ，60℃延伸34s ，共40个循环，95℃延伸15s 。以actin 为内参，2−ΔΔCt 计算。1.2.5
免疫荧光检测炎症小体NLRP3水平
将巨
噬细胞以1×105个/孔接种于24孔板，给予相应药物处理，取各组细胞爬片，4%多聚甲醛（500μl /孔）固定30min ，PBS 清洗3次，5min /次，0.5%Triton X -100（500μl /孔）透膜30min ，5%BSA 封闭30min ，加入NLRP3稀释液（1∶200，250μl /孔）4℃过夜，PBS 清洗3次，5min /次，加入cy3标记的二抗（1∶500，250μl /孔）室温避光孵育2h ，PBS 清洗3次，5min /次，加入250μl 含10μg /ml DAPI 的PBS 染核30min ，PBS 清洗3次，5min /次，荧光显微镜下观察。1.2.6
Western blot 检测细胞焦亡蛋白NLRP3、
Caspase -1、cleaved -Caspase -1水平
收集各组巨噬
细胞，加入RIPA 裂解液裂解30min ，4℃离心，取上清。BCA 法测定蛋白浓度，取10μg 总蛋白，进行
SDS -PAGE 分离，转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉溶于
0.5%TBST 配制封闭液，室温作用2h ，加入NLRP3一抗（1∶1000）、Caspase -1一抗（1∶1000）、cleaved -
Caspase -1一抗（1∶1000）和GAPDH 一抗（1∶2000）4℃孵育过夜，TBST 漂洗滤膜3次，5min /次，加入山羊抗兔二抗（1∶5000）室温孵育2h ，TBST 漂洗
3次，5min /次，ECL 法显影曝光，AlphaEase FC 软件分析显影带，目的蛋白表达=OD 目的蛋白/OD GAPDH 。1.3
统计学分析采用SPSS22.0软件进行统计学
分析，数据以x ˉ±s 表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA ）及LSD 检测，P <0.05为差异有统计学意义。
2
结果
2.1
PMA 诱导分化的THP -1巨噬细胞
光学显微
镜下可观察到未经过PMA 诱导分化THP -1单核细胞呈透亮圆形和类圆形状态，加入PMA 诱导分化24h 后则分化为巨噬细胞，多呈不规则、梭形或有伪
足状态（图1）。2.2
不同浓度葛根素对巨噬细胞存活率的影响
不同浓度葛根素（50、100、250、500、1000μg /ml ）对
ox -LDL 诱导的巨噬细胞均有不同程度保护作用。48h 时，葛根素浓度为100、250、500μg /ml 时巨噬细胞存活率最高（P <0.01），且保护效果呈剂量依赖性（图2）。因此，后续实验确定100、250、500μg /ml 为葛根素低、中、高干预剂量。2.3
葛根素对ox -LDL 诱导的巨噬细胞内脂质聚集
的影响
采用高、中、低剂量葛根素对ox -LDL 诱导
的巨噬细胞进行干预，油红O 染结果显示，未经
ox -LDL 处理的巨噬细胞内几乎无脂质沉积或仅有微量脂质（图3红部分），经ox -LDL 处理的巨噬细胞内可见大量脂质沉积，簇集成环状，几乎充满整个胞浆，细胞体积明显增大，呈泡沫样改变，葛根素
处理ox -LDL 诱导的巨噬细胞后，细胞内脂质明显减少，且呈剂量依赖性，细胞体积相对缩小（图3）。2.4
葛根素对ox -LDL 诱导的巨噬细胞炎症细胞因
子的影响
RT -qPCR 检测葛根素对ox -LDL 诱导的
巨噬细胞炎症细胞因子水平，结果显示，与空白对照组相比，ox -LDL 诱导的巨噬细胞中IL -1β、IL -2、IL -6、TNF -α水平明显升高（P <0.01），与ox -LDL 组相比，葛根素处理后巨噬细胞中IL -1β、IL -2、IL -6、TNF -α水平明显降低（P <0.01），且呈剂量依赖性
（图4）。2.5葛根素对ox -LDL 诱导的巨噬细胞焦亡蛋白的影响
免疫荧光检测葛根素对ox -LDL 诱导的巨噬
细胞炎症小体NLRP3表达，Western blot 检测焦亡蛋白NLRP3、Caspase -1、cleaved -Caspase -1水平，结果显示，与空白对照组相比，ox -LDL 诱导的巨噬细胞中焦亡蛋白NLRP3、cleaved -Caspase -1水平明显升高（P <0.05），与ox -LDL 组相比，葛根素处理后巨噬
细胞中焦亡蛋白NLRP3、cleaved -Caspase -1水平明显降低（P <0.05，P <0.01），且呈剂量依赖性（图5、6）
。
图2葛根素对ox -LDL 诱导的巨噬细胞存活率的影响Fig.2
Effects of puerarin on survival rate of macrophages induced by ox -LDL
Note ：A.Control ；B.100μg /ml ox -LDL ；C.50μg /ml ox -LDL and
100μg /ml puerarin low dose ；D.100μg /ml ox -LDL and 100μg /ml
puerarin ；E.100μg /ml ox -LDL and 250μg /ml puerarin ；F.100μg /ml ox -LDL and 500μg /ml puerarin ；G.100μg /ml ox -LDL and 1000μg /ml puerarin ；*.P <0.05，**.P <0.01vs Control ；#.P <0.05，##.P <0.01vs 100μg /ml ox -
LDL.
图1THP -1单核/巨噬细胞形态（×100）
Fig.1
Morphology of THP -1monocytes /macrophages （×100）
3讨论
AS 是心血管疾病的重要病理基础，而AS 易损斑块则是急性心血管疾病发生的重要因素，亦是导致患者高死亡率的原因之一。巨噬细胞则是AS 易损斑块形成和发展的重要参与者［8］。炎症刺激作用下，趋化血液中的单核细胞聚集并浸润至血管内膜下，在其所处的炎症微环境作用下进一步分化为巨噬细胞［9-10］。高脂环境中，巨噬细胞吞噬其微环境中的ox -LDL 和胆固醇结晶，加上机体自身清除能力有
限，导致巨噬细胞内脂质大量沉积，进而发生泡沫化，细胞体积增大，在血管局部形成脂质池，促进AS 斑块形成［11-12］。本研究在体外采用PMA 诱导THP -1单核细胞分化为巨噬细胞，ox -LDL 诱导巨噬细胞建立细胞模型，结果发现巨噬细胞在ox -LDL 作用下细胞内脂质含量明显增加，细胞体积明显增大，大量细胞发生泡沫化改变，而采用葛根素干预后，巨噬细胞中脂质含量明显下降，细胞体积缩小，泡沫化细胞数明显减少，且呈剂量依赖性改变。体外细胞实验研究表明，葛根素可抑制巨噬细胞活化，清除巨噬细胞内脂质，减少巨噬细胞炎症因子分泌［13-14］。
AS 易损斑块形成除受巨噬细胞泡沫化改变的影响外，还与其局部活跃的炎症密切相关。但巨噬细胞内脂质大量聚集情况下，这些不能被及时清除的脂质又可诱导巨噬细胞内细胞焦亡信号通路活化，导致巨噬细胞焦亡，进而释放大量炎症细胞因子，在局部促进易损斑块形成。研究证明，ox -LDL 可上调巨噬细胞中Caspase -1和炎症小体NLRP3水平，并通过激活Caspase -1信号通路促进巨噬细胞中IL -1β、TNFα和IL -2等炎症细胞因子分泌［15-16］。巨噬细胞中还含有与细胞焦亡相关的NLRP3受体和NLRP3炎症小体。一项研究通过沉默NLRP3受体，发现NLRP3炎症小体表达明显降低，并进一步通过小干扰RNA 干扰NLRP3基因表达，发现ox -LDL 诱导的巨噬细胞IL -1β分泌明显减少［17］；另有研究表明，胆固醇晶体可促进人巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化，加速AS 发展［18］；
以上研究均证明巨噬细胞
图4葛根素对ox -LDL 诱导的巨噬细胞炎症细胞因子的影响Fig.4
Effect of puerarin on inflammatory cytokines of macrophages induced by ox -LDL
Note ：A.Control ；B.100μg /ml ox -LDL ；C.Puerarin low dose ；D.Pu‐
erarin medium dose ；E.Puerarin high dose ；**.P <0.01vs Con‐
trol ；##.P <0.01vs 100μg /ml ox -
LDL.
图3葛根素对ox -LDL 诱导的巨噬细胞内脂质聚集的影响（×400）
Fig.3
Effect of puerarin on lipid accumulation in macro⁃phages induced by ox -LDL （×400）
Note ：A.Control ；B.100μg /ml ox -LDL ；C.Puerarin low dose ；D.Pu‐
erarin medium dose ；E.Puerarin high dose ；**.P <0.01vs Con‐
trol ；#.P <0.05，##.P <0.01vs 100μg /ml ox -
LDL.
图5葛根素对ox -LDL 诱导的巨噬细胞焦亡相关蛋白的影响Fig.5
Effect of puerarin on pyroptosis related proteins in macrophages induced by ox -LDL
Note ：A.Control ；B.100μg /ml ox -LDL ；C.Puerarin low dose ；D.Pu‐
erarin medium dose ；E.Puerarin high dose ；*.P <0.05vs Con‐
trol ；#.P <0.05，##.P <0.01vs 100μg /ml ox -
LDL.
图6巨噬细胞内NLRP3荧光强度（×200）
Fig.6
Fluorescence intensity of NLRP3in macrophages （×200）
Note ：A.Control ；B.100μg /ml ox -LDL ；C.Puerarin low dose ；D.Pu‐
erarin medium dose ；E.Puerarin high dose.
内脂质聚集可通过激活NLRP3信号通路，促进炎症因子分泌，导致AS发生发展。因此，ox-LDL和胆固醇晶体激活的NLRP3炎症小体可能是促进AS炎症形成的关键因素。另有多项研究表明，巨噬细胞焦亡与AS斑块不稳定密切相关［19-20］。三酰甘油体外处理巨噬细胞后，可检测到cleaved-Caspase-1水平明显上升，且出现细胞焦亡［21］。ox-LDL作用下，人巨噬细胞中NLRP3依赖的Caspase-1通路发生活化，进而促进巨噬细胞裂解、炎症因子IL-1β、IL-2、
IL-6、TNF-α大量分泌［20］。本研究通过ox-LDL体外诱导巨噬细胞，发现巨噬细胞内焦亡蛋白NLRP3和cleaved-Caspase-1水平明显升高，且巨噬细胞中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-αmRNA水平明显升高。葛根素干预后，ox-LDL诱导的巨噬细胞中焦亡蛋白NLRP3和cleaved-Caspase-1水平明显降低，且巨噬细胞中IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-αmRNA水平明显降低，且呈浓度依赖性，提示葛根素分别从转录和蛋白水平阻止巨噬细胞焦亡发生。
综上，葛根素作为中药葛根的有效成分，可有效抑制oxLDL诱导的巨噬细胞NLRP3/Caspase-1信号通路活化，抑制IL-2、IL-6、TNF-α、IL-1β等炎症细胞因子表达，从而抑制巨噬细胞焦亡，发挥抗炎和抗AS作用。细胞焦亡及其释放的大量炎症细胞因子在AS易损斑块形成、脱落及破裂等进程中起关键作用，葛
根素可靶向抑制NLRP3/Caspase-1细胞焦亡通路活化，减少炎症细胞因子产生，起效更快，为心脑血管疾病临床提供了潜在靶点，为其临床提供了新方法和依据。但葛根素对心血管的保护作用及分子机制仍需进一步研究。
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［收稿2020‐05‐09修回2020‐06‐09］
（编辑周文瑜）

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