蛋白质纯化
一．可溶性蛋白的纯化
方法
粗分离
中度纯化
精细纯化
AC
+
+
-
IEX
+
+
+
GF
-
-
+
1. 盐析
硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
2. 亲和纯化
Tag
Size (aa)
Capacity (mg/ml)
MW (kDa)
Cleavage
Elution
His
6
40
1
TEV/ Thrombin
Imidazole
GST
218
10
26
Thrombin/ PreScission
Glutathione reduced
MBP
396
10
42.5
TEV
maltose
Strep(II)
8
6
1
No need
desthiobiotin
Flag
8
0.6
1
No need
Flag peptide
2.1. Ni柱纯化
2.1.1．Ni柱纯化操作流程
1. 蛋白质上清与Ni柱填料在4℃下进行充分旋转混合(≥ 60 min)；也可以让上清液缓慢流经Ni柱（≥6 sec/drop）。
2. 上清与填料混合后，低速离心（≤ 500 x g），吸去大部分上清，然后将填料悬起，加入柱子中。也可以直接上柱。
3. 上样后先用5-10 柱体积（CV）的lysis buffer冲洗不结合的杂蛋白，然后再用低浓度的咪唑洗去弱结合的杂蛋白。在不知道清洗条件时可以进行咪唑浓度梯度洗脱（如10，20，30，40，50 mM），然后在纯度和得率之间选择最合适的咪唑浓度来进行清洗。
4. 清洗结束后，用高浓度咪唑（如200 mM）洗脱目的蛋白质。
5. 洗脱下来的目的蛋白质除电泳留样外，透析除去咪唑，并换成下一步所需的buffer。
6. 一般情况下his tag不需要切除。当需要切除时：
1）TEV：咪唑对其没有影响，可以在洗脱后直接酶切。100 OD280的蛋白质最少可用1 OD
280的TEV切过夜，温度20或4℃（20℃的效率是4℃的三倍）。
2) Thrombin：必须先除去咪唑才能进行酶切。在1 x PBS中，10 U/mg 蛋白质，4或20℃酶切过夜。可适当加大酶量或延长酶切时间。
2.1.2．Ni柱纯化注意事项
1．新的Ni柱填料存放于20%乙醇中（体积约为1:1）。在取用前，请先估算目的蛋白质的量，再决定取用的填料体积（Qiagen的Ni-NTA Superflow最大结合能力为30 mg protein/ml beads）。填料用量不要大大超过所需量，不然会结合较多的杂蛋白，难以清洗干净。
truncate可以加条件吗
2．新填料使用前，要先进行处理和平衡。填料先用ddH2O冲洗，除去乙醇。再用至少5 CV的buffer进行平衡。
3. 在使用前后，要注意不能让填料放干，不然会影响纯化的效果。
3. 每次使用结束后，填料用高浓度咪唑（如500 mM）清洗，再用ddH2O清洗，最后保存在20%乙醇中。
4. 不推荐Ni柱在柱酶切，这样效率很低。
5. 多次使用后填料需再生。再生步骤为：5 CV H2O → 3 CV 2% SDS→ 1 CV 25% EtOH → 1CV 50% EtOH → 1 CV 75% EtOH → 5 CV 100% EtOH →1 CV 75% EtOH → 1CV 50% EtOH → 1 CV 25% EtOH → 1 CV H2O → 5 CV 100 mM EDTA， pH 8.0 → H2O → 2 CV 100 mM NiSO4 → 2 CV H2O→20% EtOH。
2.1.3. Q & A
1. 目的蛋白质挂柱能力差？
可能是由于所用buffer中含有过多的detergent或还原剂如β-ME等。Ni柱填料和试剂兼容性请查阅手册。还可能是由于蛋白质折叠不正常，或折叠时将his tag包裹在内所致。可以采用的方法是：1）控制破菌条件，不可以过于剧烈；2）改变buffer条件，可能有利于蛋白质折叠稳定；3）将his tag构建到蛋白质另一端。
2. 杂蛋白很多，无法清洗干净？
解决方案有：采用更高浓度的咪唑进行清洗；在破菌或结合时加入少量咪唑（如10 mM）；减少填料使用量。
3. 蛋白质洗脱不下来？
解决方案有：采用更高浓度的咪唑进行洗脱；更换buffer。
4. 蛋白质发生降解？
更换蛋白质抑制剂，或多种抑制剂混合使用；截取其它truncates。
2.2. GST柱纯化
2.2.1．GST柱纯化操作流程
1. 蛋白质上清与GST填料在4℃下进行充分旋转混合，或可以让上清液缓慢流经GST柱（≥6 sec/drop）；
2. 在充分混合后，将混有填料的上清load上柱子；
3. 用大量的lysis buffer（1 x PBS）清洗GST柱，至没有杂蛋白流出（用bradford检测）；
4. 新鲜配制洗脱液：50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione, pH 8.0。将5-10CV的洗脱液加到柱子上，静置一段时间（如10 min），再缓慢流出（≥6 sec/drop）。
5. 洗脱后酶切：洗脱后的GST融合蛋白质溶液先透析除去reduced glutathione，然后加入PreScission或Thrombin进行酶切。
6. 在柱酶切：在洗脱之前，吸取beads，500 x g离心5 min，弃上清。然后加入酶液，进行酶切。
PreScission：酶切buffer：50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.5。
10 U/mg protein，5℃酶切4 hr。可适当加大酶量或延长酶切时间。
Thrombin：在1 x PBS中，10 U/mg protein，4或20 ℃酶切过夜。
酶切结束后，用3-5 CV的1 x PBS冲洗柱子，收集目的蛋白质。最后用洗脱液清洗beads上
残余的GST和GST融合蛋白。
2.2.2．GST柱纯化注意事项
1.GE的Glutathion Sepharose 4B Fast Flow最大结合能力为10 mg protein/ml beads。
2. GST填料使用前用至少5 CV的buffer平衡，buffer的pH范围为：6.5—8.0。
3. GST填料机械强度较差，所以在混合时要注意控制力度和时间。
4. 洗脱后，GST填料可用6 M盐酸胍或8 M尿素清洗，再生。然后用ddH2O清洗后浸泡在20%乙醇中。
2.2.3．Q & A
1. 目的蛋白质挂柱能力差？
解决方案有：1）保证充分混匀；2）检测蛋白质溶液的pH值是否在合适范围内；3）检查蛋白质溶液是否加入过多的DTT（> 1 mM）。
2. 目的蛋白质无法洗脱？
提高reduced glutathione浓度，但注意不要改变pH值；延长洗脱时间，并不定期吹打；在洗脱液中加入一些非离子型detergents如0.1% Triton X-100。
3. GST切不下来？
一般情况下，洗脱后酶切比在柱酶切效率高，所以选择洗脱后酶切；可以提高酶的用量，升高酶切温度，延长酶切时间；更换相应载体，用另一种酶进行酶切。
2.3. IgG纯化
纯化操作流程如下：
2.3.1．制备单克隆抗体
1. 购来F1代小鼠，或Bib/c小鼠，饲养一周；
2. 腹腔注射Plaston 200 ul/只 ，饲养10天；
3. 将特定细胞注入腹腔；
4. 一周起观察小鼠腹水的产生的情况，随时采集腹水。
2.3.2．硫酸铵沉淀
1. 取来的腹水用生理盐水以1:1比例稀释；

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