细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤
简单实验步骤如下:
1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.
2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟
3.PBS洗净:3min＊3
4.1%Triton: 30min.    配成50ultriton+5mlpBS
5.PBS洗净:2＊5min
6.羊血清封闭：３７度，２０分钟
７.一抗，his1；400  ４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度　１－２小时
８.４度　PBS洗净，３min＊５次
９.二抗　３７度小于一小时  加入5ug/ml的FITC-鬼笔环肽（100ug/ml储存液）室温染30-60分钟
１０.３７度　PBS洗净，３＊５min
DAPI  1：200
  凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 
我的实验检测X射线照射鼻炎癌细胞后γH2AX的数量变化
预实验步骤：
1） 辐照结束后，弃去旧培养液，4%多聚甲醛4℃固定15分钟。
2） PBS洗涤，5分钟×3次。
3） 体积分数为0.2%Triton-X 100 4℃破膜15分钟。
4） PBS洗涤，5分钟×3次。
5） 羊血清工作液室温封闭2小时。
6） PBS洗涤，5分钟×3次。
7） 0.21µg/ml一抗（梯度1:500 1:750 1：1000）37℃孵育细胞2小时。
8） PBS洗涤，5分钟×3次。
9） 2.1µg/ml 二抗（1：200）37℃避光孵育细胞1小时。
10）PBS洗涤，5分钟×3次。
11）1µg/ml DAPI染15分钟，使用时避光。
12）PBS 洗涤，5分钟×3次。
13）以及分数90%甘油封片，盖玻片细胞面朝下。
14）荧光显微镜下观察。
 
活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备
（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、
    　胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)
                　↓
        　用10％FCS　RPMI1640调整细胞浓度为
        　5×10６～１×10７／ml
                　↓
        取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)
        的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS
        稀释)灭活正常兔血清
                　↓4℃ 30min
        用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右
              1000rpm×5min
                　↓
        　弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠
        　(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇
                　↓　4℃ 30min
37度        　用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右
              1000rpm×5min
                　↓
        　加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入
        　1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，
        　视细胞浓度加入100～500μl固定液)
                　↓
        　FCM检测或制片后荧光显微镜下观察
          (标本在试管中可保存5～7天)
（二）试剂和器材
  1.　各种特异性单克隆抗体。
  2.　荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
  3.　10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
  4.　玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（三）注意事项
  1.　整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
  2.　洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
  3.　加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染。
  4.　细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染。
  附:
  1. DPBS (×10, 贮存液)
    NaCl 80g
    KCl 2g      蒸馏水加至1000ml
    Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释
    KH２PO４ 2g
  2.　洗涤液
    DPBS      900ml
    FCS 50ml (终浓度　5％)
    4％NaN３50ml (终浓度0.2％)
  3.　固定液
    DPBS    1000ml
    葡萄糖    20g (终浓度2％)
    甲　醛    10ml
    NaN３  　0.2g (终浓度0.02％)
4.　玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（三）注意事项
  1.　整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
  2.　洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
  3.　加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染。
  4.　细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染。
  附:
  1. DPBS (×10, 贮存液)
    NaCl 80g
    KCl 2g      蒸馏水加至1000ml
    Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释
    KH２PO４ 2g
  2.　洗涤液
    DPBS      900ml
    FCS 50ml (终浓度　5％)
    4％NaN３50ml (终浓度0.2％)
  3.　固定液
    DPBS    1000ml
    葡萄糖    20g (终浓度2％)
    甲　醛    10ml
    NaN３  　0.2g (终浓度0.02％)
严重同意楼上的讲解。我是做流式细胞分析的间接荧光，图简单加一抗后只洗涤一次，二抗后没有洗涤，就直接加另外一个抗体，结果做了好多次就是呈阴性反应！排除了好久才多洗涤了两次，结果很是令人满意。

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