MTT实验步骤
普通MTT法实验步骤：
1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细
胞接种到96孔板，每孔体积200ul.
2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：呈：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h，
终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。
4：比：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为
横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
药物MTT法实验步骤
贴壁细胞：
1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000- 
10000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2: 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，
细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午
加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况
3: 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
37度4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，
可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6: 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免
疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介
质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
悬浮细胞：
1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培
养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640）
2: 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用
WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
注意事项：
(1) 选择适当得细胞接种浓度。
(2) 避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈后尽量吸尽孔
内残余培养液。
(3) 设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，
最后比以空白调零。
(4) MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。
(5) 用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适
根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于
DMSO溶解甲臜颗粒进行比测定
(6) 一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。

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