das1977 wrote:
【专题讨论】
37度我还做过骨髓间充质干细胞（MSC）的原代及传代培养，下面谈谈我的传代步骤：
1. 弃去旧培养液。
2.D-Hank's液轻缓漂洗细胞两遍，尽量洗去残余血清，弃去D-Hank's液。
3 加0.25%胰酶（以盖满瓶底为标准）于37度条件下消化，倒置相差显微镜下观察，以细胞突起回缩，细胞间隙增大，细胞近乎缩成圆形为准。
4.直接加含血清的LG-DMEM培养基（或血清)终止消化。
5.用弯头吸管均匀有序的吹打细胞，动作不宜过猛，防止起泡产生。
5. 离心5分钟（1000转/分钟），去上清。
6.加入D-Hank's液吹打混匀，再离心一遍。
7. 用含10％小牛血清的DMEM培养液重悬细胞，按1：2传代。
8.补加培养液至所用瓶容积的1/10为准。
9.送孵箱培养。
我也在做骨髓间充质细胞的培养，细胞培养的新手。大鼠骨髓经ficoll分层后培养。一周换液2次。三周后，可以传代了。然后大约7天可以传代一次。跟das1977的方法稍微有点不同。
1. 弃去旧培养液。
2.预热的PBS液轻缓漂洗细胞两遍，尽量洗去残余血清，弃去PBS
3 加0.25%胰酶,0.05%EDTA于37度条件下消化，约两到三分钟，倒置相差显微镜下观察，细胞缩成圆形漂浮为准。我还用手轻轻击打培养皿的两侧，希望可以加速其消化。实验室里的人都这么干，我就有样学样了。：）
4.直接加含10%的LM-aMEM培养基（或血清)终止消化。
5.我没有吹打细胞这个过程哦。下次试试看。但是结果还是不错的。
5. 离心5分钟（1200转/分钟），去上清。
6.加入PBS液吹打混匀，再离心一遍。
7. 用培养液重悬细胞，按1：2传代。有一次贪心，按1：4传代，结果细胞数太少了，没有一瓶长好的。5555。下次不能贪心了。
8. 补加培养液。75cm2的，加10-15ml
9.送孵箱培养。
我还培养了C2C12(购自ATCC)，传代方法基本一致。就是消化时间要少好多，在培养室里转个圈回来就可以了。
给大家详细讲述一下CHO细胞的传代，培养方法:
细胞复苏后，在显微镜下观察大约有80%~100%的细胞已经贴壁时用新鲜的培养基换掉原来的培养基，去除DMSO对细胞的毒害，估计复苏到换液的时间为0.5~1.5h.
2~3d细胞长满后传代，传代前先把培养基和0.2%的胰酶从冷库放到室温1~2H，由于冷库中的培养基温度与在温房的温差很大，这样做可以防止细胞"感冒"，然后把培养瓶中的废液倒掉，加入约5~10ml胰酶，把培养瓶平放使胰酶能够浸润到瓶子的表面，放到瓶架上，把瓶架转速调到平常运转的倍，大约1M
IN后再把胰酶倒掉，一部分很少即可，拍打瓶子，看见细胞象针眼一样融融的下滑加入培养基就可以了，如果有部分还难以消化下来，使劲摇晃瓶子也能使其掉下.
1、直接倒掉DMEM培基
2、pbs将细胞洗2次
3、倒掉pbs
4、加入0.25％胰酶（0.02%EDTA）1－2ml/培养瓶
5、水平放置培养瓶，消化3－5分钟
6、显微镜下观察：细胞形态变圆，而且细胞间界限明显后，或有极少数细胞漂浮起来就可终止消化。
7、加入完全培基/血清中止消化（我的做法是：不倒掉胰酶）
8、吹打：动作要快。按一定的顺序进行吹打，尤其是边缘和角落往往是16HBE14o－细胞长得最密的地方。如果不吹打彻底，会对下一次的传代造成影响。吹打时，我个人比较喜欢用较大的吸管，这样的话液体就很难进入倒吸耳球，减少污染的可能。
9、补足培养基，如有多瓶传代，移至同一培养瓶内，混匀细胞，分装传代。
如果急着做试验的话，通常1传2。如果不着急试验，通常可以1传3或者4。
我再来讲一下293T细胞的培养。
293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。
大家注意293T细胞的一个重要特性：室温下不贴壁，但37度时可以重新贴壁。
我的293T细胞时老板从美国千里迢迢带回来的，当时正是冬天，老板把瓶子放在大衣口袋里在飞机上折腾了两天，等拿到实验室已经看不到贴壁的细胞了。我以为在外面这么久细胞可能已经冻死了，肯定没救了。
但本着死马当活马医的想法在培养箱里放了一个星期，还是不见起。正准备丢的时候，一次上网查293T 细胞的特性时看到：―室温下不贴壁，但37度时可以重新贴壁‖。
如获至宝，赶紧跑到实验室在显微镜下仔细寻，竟然真的发现少量贴壁细胞，后来经过我们的细心呵护，这些细胞终于活了下来。通过这个也让我明白了一个道理，不到最后时刻不要轻言放弃。
言规正传，这个细胞我按照老板在美国的习惯处理：
用90％的DMEM＋10％的胎牛血清培养37度培养箱。
这个细胞增殖很快，大概2－3天就要传代。需要提醒的是：细胞贴壁很疏松，换液时注意不要用力摇晃培养瓶，否则有可能会把细胞摇下来。

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