引用格式：宋　雯，陈　曦，余　君，等. 初始含水率和菌演替在雪茄烟叶发酵产香中的作用[J]. 湖南农业科学，2023（7）：82-88.　DOI:
DOI:10.16498/jki.hnnykx.2023.007.016
雪茄烟叶发酵是微生物利用烟叶本身的营养物质在适宜条件下进行生长、代谢、转化的过程[1-2]。烟叶含水率是发酵过程内在的生理基础[3]。雪茄烟叶晾制完成后含水率较低（10%~16%）[4]，不能有效满足微生物发酵对水分的要求[5]，从而导致烟叶发酵过程缓慢、发酵周期延长。孙建锋[6]的研究显示，烟叶工业醇化过程中含水率为13%，其醇化周期长达1~3 a。但是，烟叶水分含量过高也会使雪茄
初始含水率和菌演替在雪茄烟叶发酵产香中的作用宋　雯1，陈　曦1，余　君2，胡路路1，陈　雄1，王　志1
（1.湖北工业大学生物工程与食品学院，发酵工程教育部重点实验室，湖北武汉  430068；
2.湖北省烟草科学研究院，湖北武汉  430030）
摘　要：以雪茄CX-14烟叶为材料，研究了初始含水率（30%、34%、38%）对雪茄烟叶发酵产香的影
响，并通过宏基因组测序技术明确了雪茄烟叶的菌结构及功能基因变化，分析了优势菌属在发酵过程中的贡献度，探明了菌演替与雪茄烟叶香气产量变化的相关规律。结果表明：当雪茄烟叶含水率回潮至34%时，发酵后的苯丙氨酸转化产物、类胡萝卜素降解产物、西柏烷类降解产物、棕化反应产物含量和香气总量分别比发酵前提高了77.2%、167.1%、28.6%、51.5%和169.3%，香气总量分别比30%和38%含水率组提高了26.6%和21.7%；通过宏基因组学分析，发酵后葡萄球菌属（Staphylococcus）丰度占比高达87.8%，是绝对优势菌属，而且其对发酵过程中的次生代谢物生物合成、ABC转运蛋白、氨基酸生物合成等代谢过程的贡献度超过了85%；经发酵菌属与烟叶香型相关性分析，发现类胡萝卜素转化产物是香型的主要呈现者，而且葡萄球菌菌属在香型节点最突出，是呈现香型的最大贡献者。综上所述，雪茄烟叶发酵前的最适含水率为34%，发酵过程中葡萄球菌属对雪茄烟叶发酵的香气产量有显著促进作用。
关键词：雪茄烟叶；初始含水率；香气成分；宏基因组分析
中图分类号：S482.4      文献标识码：A      文章编号：1006-060X（2023）07-0082-07
 T he Roles of Initial Moisture Content and Microbial Succession in Aroma Production During
the Cigar Tobacco Leaf Fermentation
S ONG Wen1, CHEN Xi1, YU Jun2, HU Lu-lu1, CHEN Xiong1, WANG Zhi1
（1. College of Bioengineering and Food Science, Hubei University of Technology; Key Laboratory of Fermentation Engineering, Ministry of Education, Wuhan 430068, PRC; 2. Tobacco Research Institute of Hubei Province, Wuhan 430030, PRC）
Abstract：The effects of initial moisture content (30%, 34% and 38%) on the fermentation aroma production of cigar tobacco leaves were investigated using cigar CX-14 leaves as materials. The changes in the bacterial colony structure and functional genes of cigar tobacco leaves were clarified by macro-genome sequencing technology, and the contribution of dominant genera in the fermentation process was analyzed to investigate the correlation law between the bacterial colony succession and the changes in the aroma production of cigar tobacco leaves. The results showed that when the moisture content of cigar leaves regain to 34%, the contents of phenylalanine conversion products, carotenoid degradation products, cembratriendid degradation products, browning reaction products and total aroma of the fermented cigar tobacco leaves were increased by 77.2%, 167.1%, 28.6%, 51.5% and 169.3% compared with those of the pre-fermentation group, and the total aroma of the fermented cigar tobacco leaves was increased by 26.6% and 21.7% compared with that of the 30% and 38% moisture groups respectively; through macro-genomics analysis, the abundance of Staphylococcus accounted for 87.8% after fermentation, which was the absolute dominant genus, and
its contribution to the metabolic processes such as secondary metabolite biosynthesis, ABC transporter protein, amino acid biosynthesis, and other metabolism processes in the process of fermentation was more than 85%. Through the correlation analysis between fermentation bacteria and aroma types of tobacco leaves, it was found that carotenoid conversion products were the main presenters of aroma types, and Staphylococcus was the most prominent in the aroma type node and the biggest contributor to aroma types. To sum up, the optimum moisture content of cigar tobacco leaves before fermentation is 34%, and Staphylococcus can significantly promote the aroma yield of cigar tobacco leaves during fermentation.
Key words：cigar tobacco leaves; initial moisture content; aroma components; metagenomic analysis
收稿日期：2023–04–12
基金项目：国家其他部委项目（110202001039）
作者简介：宋　雯（1999—），女，湖北孝感市人，硕士研究生，主
要从事风味产品发酵技术研究。
通信作者：王　志
烟叶颜变深[7]，甚至霉变[8]。雪茄发酵温度的变化与其含水率也密切相关[9]，含水率过高会使烟叶快速升温，发酵不均；含水率过低，烟叶升温缓慢，发酵时间增加[10]。因此，适宜的含水率是雪茄烟叶发酵香气产量的前提条件。
目前，国内对于雪茄烟发酵的研究主要集中在烟叶发酵过程中成分的变化[11-12]、添加不同物料和微生物[13-15]对烟叶品质的影响等方面。郭文龙等[16]通过烟叶颜变化来判断品质的优劣，发现多酚物质转化对烟叶颜变化有直接影响；郑霖霖等[17]通过添加植酸酶、纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶提高了烟叶的总糖和氨基酸含量，降低了烟叶的蛋白质含量，提高了烟叶感官品质；张晓瑞等[18]在烟叶发酵过程中添加淀粉降解菌，有效降低了烟叶的淀粉含量，增加了香气。
宏基因组（Metagenomics）测序技术是利用新一代高通量测序技术（NGS）以特定环境下微生物体基因组为研究对象，在分析微生物多样性、种结构、进化关系的基础上，进一步探究微生物体功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系，发掘潜在生物学意义的一种新方法。与传统微生物研究方法相比，宏基因组测序技术规避了绝大部分微生物不能培养、痕量菌无法检测的缺点，因此近年来在环境微生物学研究中得到了广泛应用[19-23]。在烟草发酵方面，王文婷等[24]利用宏基因组学技术分析了霍氏肠杆菌F8-1（Enterobacter hormaechei F8-1）发酵烟叶期间表面微生物的动态变化。然而该技术在雪茄烟发酵过程中的应用研究尚未见报道。
试验以雪茄CX-14烟叶为材料，研究了初始含水率对雪茄烟叶发酵产香的影响，并通过宏基因组测序技术明确了雪茄烟叶发酵过程中菌结构及功能基因的变化，分析了优势菌属在发酵过程中的贡献度，探明了菌演替与雪茄烟叶香气产量变化的相关规律。该研究结果可为雪茄发酵过程中的精准化操作提供参考。
1　材料与方法
1.1　试验材料
供试烟叶为雪茄CX-14烟叶，由湖北省烟草科学研究院提供。主要试剂为洗涤缓冲液，配方为：Tris-HCl 15.8 g/L，EDTA-Na2 18.6 g/L，聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）20.0 g/L，NaCl 81.9 g/L，Tween-20 1.0 g/L，pH值8.0。
1.2　试验方法
1.2.1　雪茄烟叶发酵方法　雪茄烟叶采用箱式发酵，每箱烟叶40 kg，使用称重加湿回潮法对烟叶进行回潮，烟叶含水率分别回潮至30%、34%、38%，分别记为T1、T2、T3处理。将发酵箱置于发酵房内，室内温度控制在28~30℃，相对湿度控制在75%~80%，发酵周期为30 d。
1.2.2　烟叶中挥发性香气成分的测定　发酵结束后的烟叶去除主脉烘干粉碎后过60目筛，称取10 g烟末，
使用同时蒸馏萃取装置提取烟叶中的香气成分。干燥过滤后进行GC-MS分析。GC-MS检测条件如下。谱柱：HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：40℃保持2 min，以2℃/min升至200℃，保持5 min，然后10℃/min升至280℃；载气（He）流速：1 mL/min；进样量：1 μL；分流比：10∶1；采用电子轰击离子源；电子能量：70 eV；传输线温度：250℃；离子源温度：230℃；质量扫描范围：35~550  m/z。目标化合物的峰识别以美国国家标准技术研究所（NIST）数据库为准。reaction between pvp and amino
1.2.3　宏基因组样品预处理　取10 g烟叶剪碎，置入100 mL洗涤缓冲液中超声30 min，过滤，将滤液以10 000 r/min的速度离心10 min，弃上清液保留沉淀，重复操作至上清液几乎无。放入液氮罐中冷冻30 s后迅速转入－80℃保存。取34%含水率组发酵前后的雪茄烟叶作样品，发酵前记为HEQ，发酵后记为HE。
1.2.4　烟叶宏基因提取　采用NEXTFLEX™ Rapid DNA-Seq Kit试剂盒提取烟叶宏基因，操作按说明书进行。
1.2.5　宏基因测序结果分析　PE文库构建、基因组测序、序列质控与组装、基因预测与非冗余基因集构建等由上海美吉生物医药科技有限公司完成[25-26]。使用美吉云平台的在线工具进行物种与功能注释及物种贡献度分析[27-28]。
1.3　数据处理
试验数据为3组平行试验的均值，采用SPSS 26软件进行数据分析，采用Origin 2019b软件绘图。2　结果与分析
2.1　不同含水率组发酵前后香气含量变化
烟叶内的香气物质含量是烟型、吃味形成的重要影响因素[29]。对比T1（含水率30%）、T2（含水率34%）、T3（含水率38%）处理雪茄烟叶发酵前后的香气含量，结果如图1所示。
苯丙氨酸转化产物是烟叶香气成分的重要组成部分，其作用主要是突出烟叶中的花香，协调烟叶香气，使雪茄更具自然风格[30]。T1、T2及T3处
含
量
图 1　不同含水率组发酵前后香气含量
理的雪茄烟叶发酵后苯丙氨酸转化产物含量分别为11.9、16.3和12.0 μg/g，较发酵前（9.2 μg/g）分别提高了29.3%、77.2%与30.4%，T2处理的雪茄烟叶发酵后苯丙氨酸转化产物含量分别较T1、T3处理提高了37.0%、35.8%。
类胡萝卜素转化产物如β-大马酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮等可以消除烟叶刺激性，增加果香、花香、木香等，是反映烟叶香气品质的关键成分[31-32]。T1、T2及T3处理雪茄烟叶发酵后类胡萝卜素转化产物含量分别为55.4、126.1和58.6 μg/g，较发酵前（47.4 μg/g）分别提高了16.9%、167.1%和23.6%，T2处理雪茄烟叶发酵后类胡萝卜素转化产物含量分别较T1、T3处理提高了127.6%、115.2%。
西柏烷类转化产物可使烟气更加柔和，余味更加醇和[32]。T1、T2及T3处理雪茄烟叶发酵后西柏烷类降解产物含量分别为25.4、28.3和27.2 μg/g，较发酵前（22.0 μg/g）分别提高了15.5%、28.6%和23.6%，T2处理雪茄烟叶发酵后西柏烷类降解产物含量分别较T1、T3处理提高了11.4%、4.0%。
棕化反应产物可增加烟草香气，改善烟叶品质[33]。T1、T2及T3处理雪茄烟叶发酵后棕化反
应产物含量分别为11.7、14.7和18.2 μg/g，较发酵前（9.7 μg/g）分别提高了20.6%、51.5%和87.6%，T3处理雪茄烟叶发酵后棕化反应产物含量分别较T1、T2处理提高了55.6%、23.8%。
从香气总量来看，T1、T2和T3处理雪茄烟叶发酵后的香气总量均有较大幅度地升高，分别达847.8、1 073.7和882.0 μg/g，比发酵前（398.7 μg/g）分别提高了112.6%、169.3%和121.2%，T2处理雪茄烟叶发酵后的香气总量分别较T1、T3处理提高了26.6%、21.7%。这表明发酵前将雪茄烟叶含水率回潮至34%，发酵效果较好，烟叶内整体香气物质含量明显提升。
2.2　34%含水率组雪茄烟叶发酵前后的NR 物种注释
NR数据库（非冗余蛋白质氨基酸序列库）比对结果（图2）显示，在域水平上，34%含水率组雪茄烟叶发酵前细菌的相对丰度为84.25%，发酵后升至99.09%，而真菌的相对丰度从发酵前的15.68%降至发酵后的0.76%，表明雪茄烟叶发酵过程中承担烟草香气风味及香味物质生成的主要是细菌。
由图3可知，在属水平上，葡萄球菌属（Staphylococcus）是雪茄烟叶表面的优势属，发酵前后均具有优势地位，发酵后丰度占比高达87.80%；曲霉（Aspergillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、烟草属菌（Nicotiana）在发酵前期的相对丰度占比总和达22.13%，其丰度占比总和在发酵后期降至3.18%。这表明葡萄球菌属对烟草表面大多数菌属存在竞争行为。
由图4可知，在种水平上，34%含水率组雪茄烟叶发酵前期微生物多达11 573种，发酵后期降至6 754种，其中发酵前有5 571个独有种，发酵后只有752个独有种，表明34%含水率组雪茄烟叶在发酵过程中存在菌种多样性降低的现象。由图5可知，
图 2　34%含水率组雪茄烟叶发酵前后域水平的物种分布（HEQ：发酵前；HE：发酵后；下同）
图 4　34%含水率组雪茄烟叶发酵前后种水平的Venn图
发酵前后烟叶表面主要优势菌种为尼泊尔葡萄球菌（Staphylococcus nepalensis）、木糖葡萄球菌（St
aphylococcus xylosus）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、冠突曲霉（Aspergillus cristatus），其中尼泊尔葡萄球菌、木糖葡萄球菌和腐生葡萄球菌均属于葡萄球菌属，且尼泊尔葡萄球菌在发酵后丰度占比高达66.28%，为烟叶中的绝对优势种，与属水平结果一致。
2.3　34%含水率组雪茄烟叶发酵前后的菌属及功能差异分析
对34%含水率组发酵前后相对丰度前15的菌及功能进行差异分析，结果如图6所示，鞘氨醇单胞菌属、甲基杆菌属的丰度占比从3.9%、3.1%均下降到0.1%；而罗尔斯顿氏菌属（Ralstonia）和拟分枝杆菌属（Mycobacteroides）的丰度占比从不足0.3%分别增加到2.0%和0.5%，其中葡萄球菌属丰度占比从57.7%增长到87.8%，远高于其他菌属。
另外，相对丰度排前15位的功能通路在发酵后均有不同程度地提升，其中糖酵解/糖异生途径提升明显，氨基酸生物合成、丙酮酸代谢及肽聚糖生物合成也有较大增幅，说明34%的含水率有利于烟叶表面菌的生长发育繁殖。菌种数量大幅提升的同时，由于葡萄球菌属在烟叶表面具有绝对优势，且对大多菌存在竞争行为，导致发酵后期菌多
样性降低。
图 3　34%含水率组雪茄烟叶发酵前后属水平的物种分布图 5　34%含水率组雪茄烟叶发酵前后种水平的物种分布
2.4　34%含水率组雪茄烟叶发酵前后的菌属与KEGG 功能贡献度变化
将34%含水率组发酵前后体系中相对丰度排前15的菌属与发酵代谢功能贡献度进行关联分析，结果如图7所示，发酵前葡萄球菌属、假单胞菌、鞘氨醇单胞菌、曲霉及甲基杆菌属对代谢功能均有不同程度的贡献，而葡萄球菌属的功能贡献度最高。发酵后由于物种多样性降低，葡萄球菌属功能贡献度进一步提升，均超过了85%。其中，假单胞菌属对双组分系统也有明显的功能贡献度，发酵前、后的贡献度分别为5.96%、3.24%，说明假单胞菌属也能较好地适应发酵过程中雪茄烟叶内部环境变化，充分利用各种物质来维持自身生存。
2.5　34%含水率组雪茄烟叶发酵前后的菌与烟叶香型相关性分析
为了明确微生物物种与雪茄烟叶中挥发性香气之间的相关关系，分析了菌属与烟叶香型的相关性，将雪茄烟叶中挥发性香气成分苯丙氨酸转化产物、类胡萝卜素转化产物、西柏烷类转化产物及棕化反应产物分别记为B 、L 、X 和Z （图8），在相对丰度占比前20的物种中，葡萄球菌属、罗尔斯顿氏菌属和分枝杆菌属均与B 、L 、X 及Z 呈现正相关，对雪茄烟叶呈香有重要影响；其中，L 节点在4种挥发性香气中最大，表明类胡萝卜素转化产物是烟叶香型的主要呈现者；而且葡萄球菌菌属在香型节点
最突出，表明其对雪茄烟叶香型呈现贡献最大。
图 6　34%含水率组雪茄烟叶发酵前后物种（A ）及功能（B ）的差异检验
A
B

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