结核与肺部疾病杂志2020 年12 月第1卷第3 期J Tuberc Lung Dis，December 2020. Vol. 1，No. 3• 245 •
•论著•
荧光P C R探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌 对利福平和耐药情况的研究
【摘要】目的评价荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction.PC R)探针熔解曲线法（简称“培解曲线法”)检测结核分枝杆菌对利福平和耐药的情况。方法对832例涂阳患者的痰标本进行BACTEC M GIT 960(简称“M GIT 960”)液体培养，结果显示污染35例.培养阴性52例，培养阳性745例，对培养阳性的745 份培养物进行菌种鉴定(基因芯片法），其中混合感染7例，非结核分枝杆菌60例，结核分枝杆菌复合678例；对 鉴定为结核分枝杆菌复合的678例患者标本采用M GIT 960液体培养药物敏感性试验(简称“M G1T 960药敏试 验”)和熔解曲线法进行利福平和耐药基因检测。熔解曲线法检测对利福平是否耐药的结果无效(无法判断
是否耐药)31例，检测对是否耐药的结果无效34例，剩余639例利福平和同时检测结果有效。以
MGIT 960液体药敏试验为参考标准，分析熔解曲线法检测耐药基因的效果。结果以M GIT 960液体药敏试验
结果为参考标准,639例患者的样本进行利福平和熔解曲线法耐药性检测，对利福平耐药性检测的符合率为
96.2%(615/639)，敏感度和特异度分别为93.3%(126/135)和97.0%(489/504)，阳性预测值和阴性预测值分别为
89. 4%(126/141)和98.2%(489/498)，尺<2沙2值为0.89；对耐药性检测的符合率为93. 6%(598/639)，敏感
度和特异度分别为83. 1%(157/189)和98.0%(441/450)，阳性预测值和阴性预测值分别为94.6%(157/166)和
93.2%(«1A丨73). 值为0.84。结论熔解曲线法对利福平和耐药性检测的敏感度高、特异度好，对
于早期诊断耐药有较好的临床意义。
【关键词】结核，抗多种药物性；聚合酶链反应；微生物敏感性试验；D N A探针；微阵列分析；对比 研究；数据说明，统计
Diagnostic value of melting curve meth(Kl in detecting resistance of Mycobacterium tuberculosis to rifanipicin and
isoniazid SLJ B/-yi, ZHOU De-wang, MA Pin-yun ^GUAN Ping, TAN Yao-ju. Laboratory of Guangzhou Chest
Hospital, Guangzhou 510095, China
Corresponding author：TAN Yao-ju »Email ： gzchtan(3163. com
【
Abstract】Objective To evaluate the efficacy of fluorescence PCR probe melting curve technique (hereinafter referred to as melting curve technique)in detecting for the resistance of Mycobacterium tuberculosis to rifampicin and isoniazid.\lethods Sputum specimens of 832 smear-positive pulmonary tuberculosis patients were cultured in liquid,and the results showed that specimens of 35 cavses were contam inated, 52 were culture negative,
and 745 were positive.Seven hundred and forty-five positive cultures were then tested with gene chip which found
7 cases of mixed infection, 60 cases of non-mycobacterium tuberculosis,and 678 cases of Mycobacterium tuberculosis
complex.The BACTEC M G IT 960 (44M GIT 960>,)liquid drug sensitivity test and melting curve method were then performed on specimens of those 678 cases to detect drug resistance of rifampicin and isoniazid.The results of the melting curve method in rifampicin detection were invalid(impossible to tell w hether it\s resistant)in 31 cases and isoniazid in 34 cases,for the remaining 639 cases valid results were reported for both rifampicin and isoniazid.
Taking M GIT 960 liquid drug serivsitivity test method as the golden standard to analyze the performance of melting curve method.Results The rate of concordance,sensitivity,specificity，positive predictive value and negative
苏碧仪周德旺马品云关平谭耀驹
高水平临床重点专科和培育专科建设项目（穗卫函〔2019〕1555号）；
广东省转化医学创新平台培育建设项目B类（粤卫函〔2018〕1254
号）
doi： 10. 3969/j. issn. 2096-8493. 2020. 03. 008
基金项目：广州市卫生健康科技项目（20181A010034)；广州市作者单位:510095广州市胸科医院检验科 通信作者：谭耀驹，
Email:***************
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predictive value to rifampicin detection were 96. 2% (615/639), 93.3% ( 126/135), 97.0% (489/504)* 89. 4%
(126/141) and 98.2% (489/498) respectively. The Kapfni  value was 0.89. The rate of concordance, sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value to isoniazid detection wer
e 93. 6% (598/639)， 83.1% (157/189), 98.0% (441/450), 94.6% (157/166) and 93.2% (441/473) respectively. The Kappa  value was 0. 84. Conclusion The melting curve method has high sensitivity and good specificity for detecting rifampicin and isoniazid resistance* thus is of great value for early diagnosis of drug-resistant tuberculosis.
【Keywords 】 Tuberculosis, multidrug-resistant; Polymerase chain reaction ； Microbial susceptibility tests ； DNA probes ； Microarray analysis ； Comparative study ； Data interpretation,statistical
结核病是严重危害人类健康的传染病之一.耐 多药结核病(M D R -T B )的出现使结核病的防控形势 更加严峻。M D R -T B 全球分布不均.印度和中国是 全球M D R -T B 疫情最严重的国家.每年新发M D R -T B
  患者数占全世界的50 %以上，并且有不断上升的趋 势1。快速诊断和M D R -T B ，对结核病防控很 有意义。B A C T E C  M G I T  960液体培养药物敏感 性试验(简称“M G I T  960药敏试验”)需要2〜4周• 往往延误了耐药结核病患者的诊治。随着结核分枝 杆菌耐药机制的研究，通过检测耐药相关基因突变 的快速分子生物学检测方法日益受到重视％。耐 药基因检测法可以及时诊断耐药.及早. 防止耐药结核病的传播。本研究用荧光聚合酶链反 应（polymerase  chain  reaction ，P C R )探针培解曲线 法(简称“熔解曲线法”)检测结核分枝杆菌复合对 利福平和的耐药基因突变，并与M G I T  960 药敏试验结果进行比较，评价其快速诊断利福平和 耐药性的检测效能及临床意义。
进行MGIT  960液体培养，结果显示阴性52例 (6. 3%)，污染 35 例(4. 2%)，阳性 745 例(89. 5%)。 对745份阳性培养物进行菌种鉴定（生物芯片法）， 其中，678份(91. 0%)为结核分枝杆菌复合，60份 (8. 0%)为非结核分枝杆菌（nontuberculous  myco -
bacteria ，NTM )，7 份（1.0%)为混合感染。对 678 例患者的痰标本进行MGIT  960药敏试验和熔解曲 线法耐药基因检测。患者标本检测流程见图1。
|涂阳患者标本832份|| MGIT  %0液’体培养832份丨
| 阴性52份(6_3%)| |H 丨性745份(89.5%) | | 污染35份(_4.2%)|
I
丨菌种鉴定745份|
资料和方法
一、 样本和试剂
1. 样本来源：收集2018年1-一
12月广州市胸科reaction研究
医院收治的832例涂阳患者痰标本。
2. 主要试剂：（1) MGIT  960培养管，营养添加
剂(（)ADC )，杂菌抑菌剂（P  A NT  A )均购自美国BD
公司J 2)结核分枝杆菌利福平耐药基因突变检测试 剂盒和结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂
盒均购自厦门致善生物科技有限公司4 3)磁珠法核
酸提取试剂由厦门致善生物科技有限公司生产。
3. 主要仪器:（1)BACTEC ™ MGIT ™ 960 系统
购自美国BD 公司；（2)全自动医用PC R 分析系统 (型号:SLAN -96P )由上海宏石医疗科技有限公司 生产；（3)Lab-Aid  824核酸提取仪由厦门百维信生 物科技有限公司生产。
二、 实验方法
1.本研究收集832例涂阳患者痰标本
图1患者标本检测流程图
2. MGIT  %0液体培养：按照操作规程,()ADC
和PANTA  1 : 1混合后（临时配制），每支MGIT
960培养管加入800 含PA N TA 的（)ADC 备用，
将832份涂阳痰标本进行液化处理：取3 m l 痰标本
置于50 m l 离心管内.加入2倍痰标本体积消化液 (4%氢氧化钠溶液与2. 9%枸橼酸钠溶液1 : 1混
合），振荡20 S ，静置15 min ，再加人磷酸盐缓冲液
(pH  值 6. 8)至 45 ml ，3000Xg ' 离心 15 min ，弃去上
清液，加人1 m l 缓冲液，混匀备用，取500^1液化后痰 标本加人到上述MGIT  960培养管中，于BACTEC ™ MGIT ™ 960系统中培养。剩余液化后痰标本收集 在2 m l 离心管中，用于熔解曲线法的检测。
3. MGIT  960药敏试验：将832份涂阳痰标本
进行培养，BACTEC ™ MGIT ™ 960仪器报告阳性 的标本先进行抗酸涂片，验证MGIT  960培养管内 的培养物是否为抗酸杆菌。如果是抗酸杆菌，
则采
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用基因芯片法进行菌种鉴定，确定678份阳性培养 物为结核分枝杆菌复合，再对其进行利福平和异 烟肼耐药性检测。
4.熔解曲线法：经液体培养、菌种鉴定后，得到 678份鉴定为结核分枝杆菌复合的阳性培养物. 将678份鉴定为结核分枝杆菌复合的阳性培养物 对应的痰标本进行熔解曲线法检测。按照熔解曲线 试剂盒
说明书操作。结果显示利福平耐药性检测结 果无效(无法判断是否耐药)31例，耐药性检 测结果无效34例，剩余639例利福平和同时 检测结果有效。
三、统计学处理
使用SPSS 17.0软件进行统计学分析。以M G I T 960药敏试验结果为参考标准，评价熔解曲 线法检测利福平和耐药性的效能。
值>0• 75表示二者之间一致性非常好，值0.4〜0•75表示二者…致性较好.咖值<0•4表示二者一致性较差。
结果
639例患者的痰标本同时获得MIGT 960液体 药敏试验和熔解曲线法对利福平和耐药性检 测结果。
MGIT 960药敏试验检测对利福平的耐药率为 21_ 1%(135/639)，对的耐药率为29. 6% (189/639)；熔解曲线法检测对利福平的耐药率为 22. l%(M l/639)，对的耐药率为26.0% (166/639)。
以MGIT 960药敏试验结果为参考标准，639 例患者痰标本熔解曲线法对利福平耐药性检测结果 有615例与MGIT 960液体药敏试验检测结果一 致.符合率为96.2%.敏感度和特异度分别为93. 3%(126/135)和 97. 0%(489/504)，值为〇.89，一致性非常好;639例患者痰标本熔解曲线法 对耐药性检测结果有598例与MGIT 960液体 药敏试验检测结果一致，符合率为93.6%(598/639)，敏感度和特异度分别为83. ]%(157/189)和98. 0% (441/450)，K咐w值为0.84，一致性非常好(表1)。
讨论
近年来，MDR-T B已成为我国结核病防控领域 的主要难题，早期检测结核分枝杆菌对利福平和异 烟肼的耐药性不仅可以提高患者治愈率，同时也可 以阻断耐药结核病在人中的传播，对耐药结核病 的防治具有重要意义。
本研究发现，熔解曲线法检测利福平耐药结果 无效31例.检测耐药结果无效34例，对上述 检测标本的阳性级别进行核对，笔者发现大部分样 本为低阳性级别标本（涂片结果为实际条数或者 “+”）。有研究表明•熔解曲线法的检测下限为100 菌落形成单位（CFU)/m P、因此，标本中结核分 枝杆菌含量较低可能造成核酸扩增及检测失败。
本研究结果表明，熔解曲线法进行结核分枝杆 菌复合对利福平和的耐药性检测具有较高 效能.其对利福平耐药性检测的敏感度（93. 3%)与 线性探针(94.3%)ra持平并高于基因芯片(84.4%) 7]。这主
要得益于熔解曲线法能够检测结核分枝杆菌混 合感染.从而提高了对利福平耐药性检测的敏感度。同时对的敏感度（83. 1%)高于线性探针(77.4%)[6]和基因芯片(80. 9%) 7]，一方面，熔解曲 线法能够检测混合感染；另一方面，熔解曲线法不仅 检测包括/wZG和/'〃///\两个耐药相关基因，同时也 检测基因。有研究表明，我国对 耐药的菌株中有约3%携带〃基因突变，因此熔解曲线法药敏试验检测的覆盖范围更广，可 以提高对耐药性检测的效能8]。
表1以MGIT 960液体药敏试验为参考标准评价熔解曲线法检测利福平、耐药性的效能
药品名称熔解曲线法MGIT960液体药敏试验
敏感度
(%)
特异度
(%)
阳性预测值
(%)
阴性预测值
(%)
值耐药(例）敏感(例）
利福平耐药(例）1261593.397.089.498.20.89敏感(例）9489
耐药(例）157983. 198.094. 693. 20.84敏感(例）32441
注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数>x100%；特异度=真阴性例数（真阴性例数+假阳性例数）x100%：阳性预测值=真阳 性例数,/(真阳性例数+假阳性例数>x100%；阴性预测值=真阴性例数__(真阴性例数+假阴性例数）x丨〇〇%
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虽然本研究表明熔解曲线法与MGIT960液体 药敏试验检测结果具有较高的一致性，但是也发现 两者检测结果存在不一致的情况，对利福平和异烟 肼的耐药性检测阳性检出率也存在差异，这种差异 是客观存在的；分子生物学检测技术检测耐药结核 病的敏感度尚未达到1〇〇%，对利福平和耐 药性检
测的敏感度仅为95%和85%%；分子生物学 检测方法通常在标本中耐药结核分枝杆菌复合占 比高于20%以上时才能检出，因此造成部分耐药结 核分枝杆菌复合的漏检[1°]，表型药敏试验结果通 常为耐药的结果；而熔解曲线法可能无法检出耐药 结核分枝杆菌复合占比低于20%的标本，导致将 标本判定为敏感。表型药敏试验结果虽然是当前耐 药性检测的金标准，但仍存在局限性，往往对于一些 低水平耐药的菌株存在漏检的情况；如分子药敏试 验检测出基因511位点和突变时，表型 药敏试验往往检测结果为阴性，因此造成两种方法 检测结果不一致[11]。有研究表明，如果分子药敏试 验检测结果为耐药，而表型药敏试验检测结果为敏 感时，进行再次重复检测，通常为表型药敏试验检测 结果错误:12]。另外，引起耐药的机制有3种，分别是 细胞壁通透性改变、外排泵机制和基因突变[13]。熔 解曲线法只是检测基因突变，如果是基因突变外的 耐药机制引起，就会导致表型药敏试验耐药而熔解 曲线法检测敏感的情况。
总之，以MGIT 960液体药敏试验作为参考标 准评价熔解曲线法药敏试验检测利福平和的 耐药性具有较高的一致性，值均>0.75，一
致性非常好。熔解曲线法能直接采用痰标本进行耐 药性检测，不需得到临床分离菌株，大大缩短了检测 时间；具有对利福平和耐药检测简单、快速、敏感度高、特异度好的优点，对于耐多药的早 期诊断有重要意义。
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(收稿日期：2020-09-15)
(本文编辑：范永德）

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