选择性反应监测技术在蛋白质组学研究中的进展及应用
单亦初;张丽华;张玉奎
【摘 要】选择性反应监测（SRM）技术作为一种重要的定向蛋白质分析技术，通过选择性检测特定母离子和子离子来排除非目标组分的干扰，增强了检测灵敏度和定量准确度，具有选择性高、重复性好、灵敏度高、动态范围宽等优点，已被广泛应用于定量蛋白质组学研究，在生命科学领域发挥着至关重要的作用。本文从分析通量、检测灵敏度、定量方法以及相关软件资源4个方面，对近期 SRM 技术的研究进展进行了综述。然后，对 SRM 技术在蛋白质组学研究包括生物标志物验证、蛋白质翻译后修饰研究、生物工程以及信号通路分析等领域中的应用进行了概述。最后，本文对 SRM 技术的应用以及发展前景进行了展望。%As an important technology for targeted protein analysis,selective reaction monito-ring technology(SRM)improves the detection sensitivity and quantification accuracy by elimi-nating the interference of impurities and co-eluting peptides by selective detection of specific mother ions and daughter ions. It has been widely applied to the quantitative proteomics study due to the advantages of high selectivity,excellent reproducibility,high sensitivity and wi
de dynamic range and plays an important role in the area of life science. For the quantitative analy-sis of the complex samples with wide dynamic range,the throughput of analysis and detection sensitivity still need to be improved. Moreover,various quantification strategies have been pro-posed to improve the accuracy and precision of quantification. Furthermore,data processing becomes more and more important with the application of SRM technology to the analysis of complex samples. In this work,the recent development of SRM technology is reviewed from the above mentioned aspects. Since SRM technology gains wider applications along with the technological development,its applications in the area of proteomics quantitative study inclu-ding biomarker validation,post-translational proteomics study( phosphorylation,glycosation, acetylation and so on),biotechnology and signaling pathway analysis are briefly described. Finally,the future developments,applications and outlook of SRM technology are described.
【期刊名称】《谱》
【年(卷),期】2014(000)004
【总页数】6页(P330-335)
【关键词】选择性反应监测;蛋白质组;定量;综述
【作 者】单亦初;张丽华;张玉奎
【作者单位】中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离分析化学重点实验室，国家谱研究分析中心，辽宁 大连 116023;中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离分析化学重点实验室，国家谱研究分析中心，辽宁 大连 116023;中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离分析化学重点实验室，国家谱研究分析中心，辽宁 大连 116023
【正文语种】中 文
【中图分类】O658
定量蛋白质组学研究受到越来越多的关注。其中，鸟法技术和SRM技术是定量蛋白质组学领域中应用最为广泛的两种技术。鸟法具有很高的分析通量，一次运行即可定量数千个蛋白质;但其缺点是无法对蛋白质的多肽信号进行连续性和选择性的检测，因此目标蛋白质信号
容易受到噪音和其他非目标组分的干扰，检测灵敏度低，并且难以实现对低丰度肽段和蛋白质的准确定量。通常情况下，人们感兴趣的不同样品中的差异蛋白质以及疾病标志物的含量较低。选择性反应监测(SRM)技术尽管分析通量较低，但是该技术通过选择性检测特定母离子和子离子来排除非目标组分的干扰，增强了检测灵敏度和定量准确度，特别适合于低丰度蛋白质的准确定量。因此，近年来基于该技术研究疾病标志物及验证差异蛋白质等已成为定量蛋白质组学的重要策略之一。SRM技术通常使用三重四极杆质谱来实现，具体原理如图1所示［1］。本文对该技术的进展及其应用进行了综述，并对未来可能的发展方向进行了展望。
图1 选择性反应监测(SR M)的技术原理［1］Fig.1 Principle of selective reaction monitoring(SR M)technology［1］
1 SR M技术进展
SRM技术与传统的基于鸟法技术的蛋白质组定量方法相比，由于有效提高了对离子的选择性，在一定程度上提高了对中、低丰度蛋白质的检测能力。然而由于蛋白质组样品复杂度高、动态范围宽，进一步提高检测灵敏度仍然是一个重要的研究目标。由于SRM技术需要对
肽段进行连续扫描，因而对复杂样品分析所需的时间较长，为此近年来研究者也致力于提高SRM技术的分析通量。此外，通过发展新方法提高蛋白质定量的准确度也是该领域的研究热点之一。最后，随着SRM技术逐渐应用于大规模的蛋白质组定量研究，相关数据的处理也变得越来越重要。为此人们也在不断发展相关的软件和数据库。本文从分析通量、检测灵敏度、定量方法以及相关软件资源4个方面，对近期SRM技术的研究进展进行了综述。
1.1 分析通量
基于质谱的SRM技术与传统的定向蛋白质组学技术(如Western blot)相比，分析通量有所提高，并且不受抗体的制约。然而为缩短生物标志物发现周期，需要改进数据采集或者处理方法，进一步提高SRM技术的分析通量。
Kiyonami等［2］率先提出了一种新的数据采集方法——智能选择反应监测(intelligent selected reaction monitoring，iSRM)。该方法通过设定主要和次要母子离子对，在预先设定的洗脱时间窗口内对主要母子离子对进行连续监测以准确定量每个多肽;此外，同时采用数据依赖模式监测6～8个次要离子对。当主要母子离子对信号强度达到一定阈值时，触发次要母子离子对的采集，实现对肽段的定性确认。以酵母的胰蛋白酶酶解产物的分析为例，其检测
限低至10 amol水平，通量达到每分钟100母子离子对。该方法在保证SRM的选择性和准确性的前提下，可以在固定的采集时间内分析更多的肽段，从而提高了目标蛋白质组分析的选择性、准确度和通量。在此基础上，毛心丽等［3］建立了依赖谱保留时间的iSRM方法，并对不同复杂程度的蛋白质样品进行了分析。该方法与不依赖谱保留时间的iSRM方法相比，可以显著提高肽段及蛋白质的鉴定数目，目标肽段和蛋白质的鉴定数目分别从312和217提高到449和280。
近期AB Sciex公司推出了SWATH(sequential window acquisition of all theoretical fragment-ion spectra)技术。该技术采取非数据依赖采集方法，连续运行32个25 Da宽的母离子分离窗口，并对每个窗口内的母离子进行全碎裂。利用碎片离子谱图库来挖掘共碎裂多肽二级谱中特定多肽的特征碎片离子，进而实现了对多肽的同时鉴定和定量。Gillet等［4］通过实验验证发现该方法的定量动态范围可达到4个数量级。与SRM技术相比，两者在定量准确性及一致性方面相近，但SWATH技术可在一次运行中同时实现蛋白质样品的全谱鉴定和定量，具有更高的分析通量。
1.2 检测灵敏度
由于采取两次质量选择过滤，SRM技术有较高的灵敏度。与传统的基于质谱的蛋白质组学技术相比，SRM技术在分析复杂生物样本时为靶向式获取目标离子，减少了其他离子的干扰，因此与经典技术相比其灵敏度可提高一个数量级［1］。然而由于蛋白质组样品具有很宽的动态范围，对低丰度蛋白质的检测仍然存在挑战。为此，人们通过发展样品分级技术，如亲和富集、高丰度蛋白质去除以及高灵敏度的质谱接口等，进一步提高了SRM技术的灵敏度。
Whiteaker等［5］提出了 SISCAPA(stable isotope standards and capture by antipeptide antibodies)方法。采取多重免疫策略，使用一个蛋白质的至多5条肽段对动物进行免疫，从而产生相应的多肽抗体;然后利用抗体对目标蛋白质多肽进行富集，并结合稳定同位素稀释的方法，使用SRM技术进行质谱检测和定量。利用该方法可以检测到血浆中质量浓度低于100 ng/mL的蛋白质。
Hossain等［6］发展了一种多毛细管入口/双电动离子通道接口(multi-capillary inlet/dual electrodynamic ion funnel interface)，并结合SRM 技术实现了蛋白质的定量分析。与传统的SRM接口相比，采用该接口可以通过提高离子传输效率，显著提高检测灵敏度。对于血浆蛋白质样品，不仅峰强度平均提高了70倍，检测限降低了10倍，而且还提高了分析的重现性，
无须免疫去除高丰度蛋白质即可实现血浆中40～80 ng/mL蛋白质的检测。此外，Rafalko等［7］利用芯片等电聚焦对目标多肽进行选择性富集后，采用SRM技术对血浆中的前列腺特异性抗原进行了检测，其定量限可低至1～2.5 ng/mL。
1.3 SR M相关定量方法
SRM的定量分析从方法上讲一般分为相对定量分析和绝对定量分析，其中相对定量方法包括无标记和标记定量方法。最初通常使用无标记定量方法［8］进行SRM定量。为了消除液相谱分离和质谱检测重复性不够高引起的定量误差，进一步提高定量的准确度和精密度，人们发展了多种同位素标记定量方法，包括代谢同位素标记方法(如［15N］硫酸铵标记)［9］，化学同位素标记方法(如同位素编码的亲和标签标记(ICAT))［10］以及酶解辅助稳定同位素标记方法(如［18O］水标记)［11］。

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