PCR技术发展与应用的研究进展
摘要：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是最常用的分子生物学技术之一，通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增．定量PCR技术是克服了原有的PCR技术存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等，快速PCR技术快速PCR在保证PCR反应特异性、灵敏性和保真度的前提下，在更短时间内完成对核酸分子的扩增．mRNA 差异显示PCR技术是在基因转录水平上研究差异表达和性状差异的有效方法之一．近年来已经开展了许多这三方面的研究工作，本文就定量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示PCR技术作一综述，以便更好地理解及应用这项技术。
  关键字：定量PCR；荧光PCR；快速PCR；DNA聚合酶；mRNA差异显示PCR
聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术由于PCR简便易行、灵敏度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究。但是，由于传统的PCR技术不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其在临床上的应用受到限制[1]。鉴于此，对PCR产物进行准确定量便成为迫切的需要。几经探索，先后出现了多种定量PCR (quantitative PCR，Q-PCR)方法，其中结果较为可靠的是竞争性PCR和荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR，FQ-
PCR)。
随着生命科学和医学检测的不断发展，人们越来越希望在保证PCR反应特异性、灵敏性、保真度的同时，能够尽量缩短反应的时间，即实现快速PCR(Rapid PCR or Fast PCR)。快速PCR技术不仅可使样品在有限的时间内可以尽快得到扩增，而且可以显著增加可检测的样品数量，显然，在大批量样本检测和传染病快速诊断等方面将会有重要的应用前景。例如，快速PCR在临床检测中可大大加快疾病的诊断效率；在生物时能有效帮助快速鉴定可疑物中有害生物的存在与否；同时，由于PCR已经渗入到现代生物学研究的各个方面，快速PCR的实现必然可以使许多科学研究工作的进展显著加快，最终影响到整个生物学发展的速度。近年来，快速PCR技术得到了可喜的进展。从聚合酶的改进、添加剂的开发以及热循环仪的革新创造三个不同途径上分别进行的研发表明。
生物的性状和生物对各种生物、理化及致病因子的应答，本质上都是基因在时间上或空间上选择性表达，即基因的差异表达的结果，因而，获取差异表达的基因信息，将有助于了解生物的生理变化和病理改变的分子机制[2]。研究基因差异表达主要技术有：消减文库筛选、差异杂交、代表性差异分析、基因表达序列分析、电子消减技术[3]和mRNA差异显示PCR技术
等(mRNA Differential Display PCR，简称DD-PCR[4] )。迄今为止，上面的几种方法已成功地用于基因差异表达的研究。尤其是mRNA差异显示PCR技术，虽然发明只有短短十几年，已经取得了令人瞩目的科研成果，原因是它具备需要总RNA 的量极少，不需要纯化的mRNA，操作简便、快速、灵敏等优点[5-8]，故已被许多生命科学实验室作为一种重要工具，应用于体内和体外差异表达基因的筛选，研究基因功能[9]。现将定量PCR技术、快速PCR技术、mRNAreaction研究差异显示PCR技术研究情况作一综述作简要综述。
1 定量PCR技术
定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。广义概念下的定量PCR技术可以分为五种类型：
  （1）外参法+终产物分析，是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。
  （2）内参法+终产物分析，是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。
（3）外标法+过程监测，这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。
（4）内参法+过程监测，由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竞争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。
（5）外标法+过程监测+内对照，这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。这种类型是应该提倡的。
1.1  竞争性PCR技术
定量PCR技术是对传统PCR技术的进一步发展和补充，在定量过程中需借助各种形式的参照物。参照物是一种已知含量的标准模板，按其是否与待测样品在同一反应体系中扩增而分为内参照和外参照。鉴于PCR扩增过程中管与管之间的扩增效率存在差异，理想的定量PCR应该使用内参照。竞争性PCR即是采用内参照的一种定量PCR方法，通过消除管间及样品间的变异，从而达到较为精确的基因定量[10]。该方法是将待测基因与已知浓度的内参照模板在同一反应管中共同扩增，由于二者具有相同引物的结合位点并采用同一引物进行扩增，因此二者竞争引物、脱氧核苷酸以及DNA聚合酶，以致当一种模板量逐渐增加时，另一种模板的扩增产物就会逐渐减少。两模板的扩增产物量可分别用以下公式表示：Y待测= X待测(1+E)n；Y内参照= X内参照(1+E)n，其中X待测为起始拷贝量；Y待测为扩增产物量。由于在同一反应体系中扩增，两模板的循环次数n保持一致，如果使两者间的扩增效率E也相同，就存在如下关系：Y待测/Y内参照= X待测/X内参照。当两模板的产物量相同时，则两模板的反应起始拷贝数相等，由此可对待测模板进行精确定量。具体检测方法是将已知浓度的内参照模板倍比稀释后分别与恒定量的待测基因一起扩增，以参照模板的起始拷贝数为横轴，以两模板扩增产物量的比率为纵轴，作出标准曲线，纵坐标为1的点所对应的参照模板的起始拷贝数即为待测基因的拷贝数。由上述定量原理可知，保持两模板扩增效率E的一致性是定
量的关键，为此要求参照模板应与待测基因具有相似的大小及序列，相同的引物结合位点。此外，参照模板还应在扩增后易于分离检测。因此，对于竞争性PCR的研究重点主要集中在建立高效、稳定、可靠的模板方面，现已取得了较满意的结果[11-13]。　
1． 2  荧光定量PCR技术
荧光定量PCR（RQ-PCR技术）是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。Ct值( cycle threshold，Ct )，即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
1.2.1 Taqman技术
Taqman 技术由美国PE公司开发，现已广泛用于基因检测。该技术的原理是利用Taq 酶的5’-
3’外切酶活性，在传统PCR技术一对特异性引物的基础上增加了一条荧光双标记探针。该探针可与上、下游引物之间的DNA模板序列特异性结合。探针的5’端标以荧光报告基团，如FAM(62羧基荧光素)；3’端标以荧光淬灭基团，如TAMRA(62羧基四甲基诺丹明) 。当探针保持完整时，两个基团的空间距离非常接近，构成荧光能量传递( FRET) 关系，5’端荧光报告基团发出的荧光信号被3’端淬灭基团吸收，使其不能被仪器检测。当两个基团发生分离后，两者间的FRET关系被破坏，淬灭基团的抑制作用解除，报告基团的荧光信号便得到释放。在PCR退火复性期，探针与DNA 模板特异性结合。在PCR延伸阶段，Taq酶在引物的引导下，以四种脱氧核苷酸为底物，按碱基配对原则沿着模板合成新链，当移动至探针结合的位置时便发挥其5’-3’外切酶活性将探针降解成单核苷酸，使得荧光报告基团与淬灭基团分离，前者的荧光信号释放并被检测。由此可见，每合成一条新链就有一个探针被裂解并释放出一个荧光信号。根据这种关系，通过检测PCR反应液中的荧光强度，再经校正计算后即可得出初始模板的数量。Taqman技术现主要用于病毒的定量分析，病原体的分型鉴定，基因的快速诊断分析[14-16]。
1.2.2 AmpliSensor 技术
该技术与Taqman PCR的区别在于其采用的是复合探针。一个探针上标以荧光报告基团，另一个探针上标以荧光淬灭基团，后者的5’端较前者多出7个碱基( GCGTCCC)。两探针之间能因碱基互补而结合，此时两基团靠近而形成FRET结构，报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收。当两探针分开后，其间的FRET关系受到破坏，淬灭基团的抑制作用解除，报告基团的荧光信号得到释放。在PCR扩增前需将该复合探针与一个半套式PCR引物连接，该引物的5’端应具有一段与长探针上多出的7个碱基互补的序列，以便DNA连接酶能将该引物与短探针连接。扩增时该探针2引物复合物作为半套式引物掺入到模板，并释放出淬灭探针，使原有的FRET结构破坏，从而释放出报告基团的荧光信号，其强度与被扩增的模板数相对应。Matera G等[17]用AmpliSensor技术对丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus HCV)的基因型进行检测，发现此方法具有很高的特异性，能准确检测待测标本中DNA的基因型和含量。
1.2.3 Lightcycler技术
Lightcycler技术是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术。该技术的特点[18,19]也是将荧光报告基团和淬灭基团分别标记在两个不同的探针上，形成荧光探针和淬灭探针。荧光报告基团标于探针的5’端，荧光淬灭基团标于探针的3’端，两探针能分别与模板同一条链中相邻
的核苷酸序列进行杂交。当探针游离时能检测到报告基团的荧光信号； 如果反应体系中存在特异性模板，PCR复性阶段两探针即会与之杂交，此时两探针上的荧光报告基团和淬灭基团相距很近，形成FRET关系，前者的荧光信号被后者吸收，即发生荧光淬灭。由于荧光淬灭的程度与被扩增的模板量相对应，因此可达到定量的目的。Kearns AM等[20,21]报道，Light-cycler技术在对病毒DNA的快速分型和定量方面有特殊的优势。

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