Azocasein法测定嗜冷菌耐热胞外蛋白酶活
性研究
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中国乳品工业
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Azocasein法测定嗜冷菌耐热胞外蛋白酶活性研究
王辉，吕加平，迟玉杰
(1.东北农业大学食品学院，哈尔滨150030;2.中国农科院农产品加工研究所，北京100094)
摘要：人工底物偶氮酪蛋白(azocasein)在酶的作用下释放发团，通过分光光度法可以定量嗜冷菌蛋白酶活性.经波长扫描，确定发
物质最大吸收波长为345nm.通过单因素试验，表明试验的最佳参数为：底物与酶反应时间2h,TCA质量分数为12%,TCA终止反应
后溶液静止时间30min；该方法在一定浓度范围内线形关系良好(Re=0.9913)，样本标准差为8.3×101.4x10一，变异系数为0.21%～
0.54%，检测限为1.33U/mL；通过对UHT中嗜冷菌蛋白酶活性测定，表明酶活性随温度升高，培养时间延长而增加.
关键词：偶氮酪蛋白；嗜冷菌；蛋白酶
中图分类号:Q55文献标识码:A文章编号:1001—2230(2007)07—0013—04 Studiesondeterminationofheatresistantextracellularproteinase frompsychrotrophicbacteriabyazocasein
W ANGHui,LVJia—ping2,CHIYu--3ie
(1.NortheastAgriculturalUniversity,CoUegeofFoodScience,Harbin150030,China;2.Ins tituteofAgro—FoodScience
&Technology,CAAS,Beijing100094,China)
Abstract:Anartificialsubstrate(azocasein)wasusedtOquantifytheproteinaseactivityfrom psychrotrophicbacteriathroughthereleaseof achromogenicproductthatwasmeasuredspectrophotometric—ally.Thehighestabsorbancyofachromogenicwasobtainedat345nm.Through thesinglefactorexperiments,theresultindicatedtheoptimumparameterwere:trichloracetic acidconcentration12%,reactiontimebetween
enzymeandsubstrate2h,stilltime30min.Themethodhaveoptimumlinearrelationship(R2= 0.9913).Theprecision,measuredascoefficientof variationandstandarddeviation.was0.21%～0.54%and8.3×10～  1.4x10一respectively.Theproteinaseactivityofpsychrotrophicbacteriain UHTmilkincreasedwithtemperatureandtime.
Keywords:azocasein;psychrotrophicbacteria;proteinase
0引言
我国UHT-~L消费量近几年增长势头迅猛，但原料
乳中细菌总数较高，其中嗜冷菌(以假单胞菌为代表)
占有较大比例，而嗜冷菌在冷藏运输过程中会产生耐
热蛋白酶，这种胞外蛋白酶即使超高温处理后也有一
定残留，该残留酶活长时间缓慢作用于乳蛋白使uHT
乳在货架贮存过程中可能出现蛋白凝结(陈化凝胶)
和乳清析出和苦包等质量缺陷问题l1,21，特别是在夏季
南方炎热地区更是多见.嗜冷菌蛋白酶大多属于耐热
碱性金属蛋白酶,Zn.和Ca是酶活性中心，最适温度
30-40oc，最适pH值为6--8，它主要7g~K-酪蛋白生成
收稿日期:2007—02—28
基金项目：国家科研院所社会公益项目(2002005DIA4G0357).
作者简介：王辉(1974一)，女，讲师，研究方向为乳品科学与技术.
通讯作者：吕加平
副,c一酪蛋白，从而失去了,c一酪蛋白对蛋白质的稳定
作用，使蛋白聚集，并逐渐析出乳清.一般测定嗜冷
菌蛋白酶方法有福林一酚，琼脂扩散，茚三酮,2,4,6一三硝基苯磺酸(TNBS)等.近两年又开始运用I%P--HPLC 和荧光胺方法I，但这些方法在使用上都存在局限性. 因此.研究建立乳中嗜冷菌胞外蛋白酶活性检测方法具有重要现实意义.
偶氮酪蛋白(Azocasein)是一种橙物质，在酶的
作用下生成偶氮有机化合物，用三(TeA)沉淀
终止反应后的多余底物，依据发光生成物生成的浓度不同.在紫外吸收波长下测定其吸光度值来定量酶的活性国外文献有以偶氮酪蛋白为底物测定酶活力的研究报道，但对于偶氮化合物的最大吸收波长说法不一
，如440,420,340,345nm等，为此，本文通过4'~200-
450nm范围内进行吸收波长扫描，以便确定其最大吸收波长，同时选择了检测方法的最佳参数，并对样品
进行测定.
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研究报告ResearchPapers
1材料与方法
1.1材料与设备
荧光假单胞菌(PseudomonasFluorescens,
AS1.1802),azocasein，中性蛋白酶(2×10sU/g)，生鲜
牛乳,uHT乳(购于超市),pH值为7.2磷酸缓冲液，三
(TCA分析纯)等.
TGL一16G高速台式冷冻离心机,U-3010~光
度计，微量可调式移液器，旋涡混合器，培养箱等.
1.2方法
用azocasein(偶氮酪蛋白)法进行测定，参照文
献『61]中检测方法并加以改进，每个样品重复3次，数据用DPs软件系统处理.
1.2.1最大吸收波长的选择
分别以偶氮酪蛋白和酪蛋白为底物，与中性蛋白
酶作用，用质量分数为5%的TcA终止反应后对样品在200~450nm范围内进行波长扫描，开始要进行基线校正，通过扫描图确定发物质最大吸收波长.
1.2.2标准曲线的制作
Azocasein底物溶液的配制：用pH值为7.2磷酸缓
冲液配制质量分数为0.5%的azocasein~液，操作无菌
条件下进行.并在冰箱中稳定2～3d备用.
5U/m_L酶液配制:~tv.5omg酶_÷1O0raLpH值为
7.2缓冲液一稀释两倍--~1o倍一5U/mL
按表1制作标准曲线.
表1标准曲线制作mL
按上表混合后于37℃反/g30rnjn一5%TcA4m.L
终止反应_÷室温静止30rnjn_÷95000r/min,5rnjn_÷
视情况滤纸过滤一345nm测吸光光度值.
1.2.3嗜6-菌蛋白酶和底物反应时间的选择
以质量分数为0.5%f/~氮酪蛋白为底物，以嗜冷菌
酶液(用0.22m微滤膜除菌)为蛋白酶待测液,TCA
质量分数为5%，终止反应后静止时间为30min，其他试验条件不变，按上述方法分别测定反应0.5,1,2,3,4hreaction研究
后的吸光光度值.
1.2.4TCA-~.止反应后最佳静止时间的选择
以质量分数0.5%fN氮酪蛋白为底物，以滤菌后嗜
冷菌酶液为待测蛋白酶,TcA质量分数为5%，反应时
间为1h，其他试验条件不变，按上述方法分别测定静
止10,20,30,40,60min后的吸光光度值.
1.2.5TCA浓度的选择
以质量分数为0.5%偶氮酪蛋白为底物，以滤菌后
嗜冷菌酶液为待测蛋白酶,，终止反应后静止时间为
30min，反应时间为1h，其他试验条件不变，按上述方
法分别测定TcA质量分数为5%,8%,12%,16%,20%后的吸光度值.
1.2.6精密度试验
取4个不同浓度的酶液，按上述方法与底物作用
并进行测定，每个操作重复4次，计算标准差SD和变异系数CV%.
1.2.7样品测定
(1)模式嗜冷菌与野生分离嗜冷菌酶活性的测
定.模式嗜冷菌(荧光假单胞菌)的活化一另取生鲜
牛乳一4℃冰箱放置10d一分离纯化.经镜检和菌
落观察，选择一株优势菌(初步鉴定为假单胞菌)一9500r/min,10min离心除菌体，取上清液微滤除
菌后备用.
将10mL的uHT乳无菌吸入灭菌试管中，每管分
别接入模式菌与野生分离菌酶液500L，于28℃保温
培养，分别在27,45,50,55h时取样，用上述方法测定
嗜冷菌蛋白酶活性，对反应2h的蛋白酶酶活分别进行测定，同时比较二者吸光光度值变化程度.
(2)uHT乳贮藏温度，时间与蛋白酶活性关系的
试验.模式嗜冷菌液(1×10SmL)各1II止加入10mL的uHT乳中，然后分别于4,8,12,16,25℃培养，并于
第2,3,4,5,6d分别取样，测定蛋白酶活性(整个过程
需无菌操作).
2结果与讨论
2.1波长扫描

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