β-淀粉酶的活性和热稳定性研究
田辉，张红，张剑∗
（武汉工业学院化学与环境工程系，湖北武汉430023）
摘要本文借助DNS试剂并通过分光光度法建立了在底物存在条件下β-淀粉酶的活性测定方法。并用该法从温度、淀粉浓度以及钙的添加量等方面探讨了β-淀粉酶的活性和热稳定性。研究表明，该酶作用底物的最适酸度为4.5，钙离子的添加量直接关系到β-淀粉酶的活性和热稳定性。当向2%（v/v）初始浓度的淀粉溶液中加入34 μmol CaCl2 / μg 酶蛋白量时，可使该酶的热稳定性和催化效率达到最大，在30℃和pH 4.5 的条件下，该酶的催化活性是对照酶的1.25倍。由此可见，向酶水解淀粉的反应液中添加适量的Ca2+，可提高β-淀粉酶的利用率。
关键词β-淀粉酶；酶活力；Ca2+离子；热稳定性酶
Studies on Thermal Stability and Activity of β-Amylase
TIAN, Hui    ZHANG, Hong    ZHANG, Jian*
( Department of Chemistry and Environmental Engineering, Wuhan Polytechnic University,
ChangQing Garden, Hankou, Wuhan, 430023 )
Abstract A determination method for activity of β-amylase in presence of starch had been established by spectrophotometry in accordance with DNS procedure. Thermal stability and activity of β-amylase were studied from the aspects of temperatures, starch concentrations and additions of Ca2+ in this paper. The results indicated that β-amylase displayed a pH activity optimum of 4.5 and addition of Ca2+ was directly related to catalytic efficiency and thermostability of β-amylase. When addition of CaCl2 was 34 μmol / μg enzyme protein, thermostability and activity of the enzyme in the presence of starch achieved maximum values. Catalytic efficiency of β-amylase incubated at 34 μmol CaCl2 / μg enzyme protein solution (30o C, pH 4.5) was approximately 1.25-fold as the control enzyme during starch hydrolysis reaction. Therefore, thermal stability of β-amylase was able to improve in saccharifying by addition of a proper amount of Ca2+.
Keywordsβ-amylase; enzyme activity; calcium; thermostable enzymes
1 前言
∗
指导教师，E-mail:******************
第一作者简介：田辉，湖北汉川人，从事工业酶制剂的应用研究。
湖北省教育厅（NO.2008B017）资助项目.
β-淀粉酶（1, 4-α-D-glucan maltohydrolase, EC 3.2.1.2），是一种外切型酶，它能从直链淀粉、支链淀粉以及葡聚糖分子的非还原性末端随机地剪取葡萄糖单元，产生麦芽糖（β-型式）[1-3]。β-淀粉酶广泛存在于麦类植物中的胚芽、大豆的种子、土豆的块根以及其他谷类植物（如大麦、小麦、玉米）和一些微生物体中[4-6]。作为一种糖化剂，β-淀粉酶被广泛的应用于啤酒酿造、麦芽糖浆以及食品加工工业中[7-8]。
目前，有关β-淀粉酶的报道大都集中在对酶的纯化和酶学特性研究方面[9,10]。酶在底物中的活性和热稳定性国内未见报道，国外的报道也甚少，究其原因是缺乏一种合适的定量方法。事实上，β-淀粉酶在底物中的活性和热稳定性，对于指导工业加工与生产尤为重要[11,12]。本文借助用于测定糖含量的DNS方法，利用分光光度计，探索出一种测定β-淀粉酶在水解淀粉过程中的活性方法，并利用该方法研究了温度、底物浓度、底物中钙用量对β-淀粉酶的活性和热稳定性的影响。研究表明，底物中钙的添加量直接关系到β-淀粉酶的催化效率，当钙离子加入量为34 μmol / μg 酶蛋白时，β-淀粉酶的活性和热稳定性可取得最大值，钙离子的存在可以减轻β-淀粉酶在高温条件下的热失活。为此，该研究有望对β-淀粉酶的贮存，运输以及合理利用提供重要参考。
2  材料与方法
2.1  材料
β-淀粉酶由湖北孝感金龙泉啤酒有限公司提供，经SDS-PAGE法测其分子量为50 kDa，其浓度通过考马氏亮蓝法测得为：22.90 mg / mL；3，5-二硝基水杨酸（DNS）和土豆淀粉从Sigma公司购得；其他试剂均为分析纯，由上海国药化学试剂厂提供。
2.2  方法
2.2.1  β-淀粉酶活力
按3，5-二硝基水杨酸法[13]。DNS，配制后经放置二十天后使用。具体操作如下：取适当稀释倍数的酶液0.8 mL于9.2 mL 2% (v/v) 的可溶性淀粉溶液中（pH 4.5，柠檬酸和磷酸氢二钠的缓冲液），淀粉和酶的溶液在30℃时预热5 min后再混合。反应15 min 后，移取0.5 mL混合液到1.5 mL DNS试剂中，立即放入沸水浴中加热15 min，随后迅速冷至室温，再用10.5 mL二次蒸馏水稀释。用分光光度计于550 nm 处测定。吸光度对麦芽糖的线形回归方程为：y = 0.719 x - 0.0189; r = 0.9989。该曲线用于计算β-淀粉酶水解淀粉的实验中所释放出的还原糖量。
β-淀粉酶活力定义为：30℃、15 min内，水解淀粉释放出1 mg麦芽糖所需的酶量为一个酶活力单位。
2.2.2  β-淀粉酶的热稳定性
reaction研究
将0.293 μg酶蛋白/ mL培养于不同温度下，每隔一定时间取出0.8 mL的酶混合
液，按β-淀粉酶活力测定方法测其酶活力。
为了测定钙离子浓度对β-淀粉酶的热稳定性影响，将酶培养在不同浓度的钙离子溶液中，定期取出，按测定β-淀粉酶活力标准方法确定各时段的酶活力。
2.2.3  淀粉溶液中的β-淀粉酶热稳定性
取0.5 mL 酶（29.3 μg 酶蛋白 / mL ），溶于49.5 mL 不同浓度的可溶性淀粉溶液中，于不同温度下培养，每隔一段时间（20、40、60、80、100、120 min ）同时取出两份式样。其中一份样品（0.8 mL ，0.2345 μg 酶蛋白），它的随后操作步骤按β-淀粉酶活力测定方法进行，据此求出10 mL 可溶性淀粉溶液中的总糖量（A 1）；对于另一份样品（0.08 mL ，0.02345 μg 酶蛋白），加入到预先吸有0.42 mL 缓冲液（pH 4.5）和1.5 mL 的DNS 试剂中，直接测其还原糖量（A 2），进而计算出0.8 mL 的反应混合液中的含糖量（10 A 2）。这样，（A 1-10 A 2）就是0.2345 μg 酶蛋白在30℃的15 min 内产糖量。因此，β-淀粉酶在淀粉溶液中的酶活力就可通过下式求出： m = 2345
.0)10(21A A − A 1—— 用于测定酶活力的10 mL 可溶性淀粉溶液中的总糖量
10 A 2—— 0.8 mL 的反应混合物中的含糖量
m—— 淀粉溶液中的酶活力
为了测定钙离子浓度对淀粉中β-淀粉酶的热稳定性影响，将不同浓度钙离子（0、17、34、68、136 μmol CaCl 2 / μg 酶蛋白）加入到酶与淀粉的反应液中，按照淀粉
中β-淀粉酶的活力测定方法测定酶活力。
3  结果与讨论
3.1  酸度的影响
pH 值是影响酶活的最主要因素之一，它决定着酶分子极性基团的解离状态，并影响着酶分子构象的稳定性，同时对底物的解离也起到关键性作用。因此，pH 值关系到酶的活性及酶与底物亲和力的大小[14]。
将淀粉与酶置于几个酸度下，按β-淀粉酶活力的标准方法测其活力。β-淀粉酶作用底物的最适pH 值为4.5，其酶活力为45.67 U / μg 蛋白。酶在一个较宽的pH 范围能保持稳定，在pH 3.0- 6.0之间，能保留最大酶活力的65%当pH 值高于7.0时，酶不稳定。
3.2  β-淀粉酶的热稳定性
许多关于β-淀粉酶作用底物的最适温度的报道[15]对于指导工业生产并没有多大意义。因为在高温条件下的短时间内，酶作用底物仍能获得高产率，但高温引起的酶失活现象十分严重。为此，在短时间内讨论酶作用底物的最适温度，并不具有实际意义。就拿本研究来说，在反应初始阶段的15 min 内，1μg β-淀粉酶在30℃、35℃、
40℃、45℃、50℃、55℃时的产糖量分别为45.68 mg、66.86 mg、73.72 mg、81.83 mg、76.38 mg、65.18 mg，单凭这组数据我们并不能得出β-淀粉酶作用底物的最适温度是45℃。为了更好地服务工业生产，必须进一步掌握酶作用底物的最适温度第一手资料，而这一切就得全面考虑酶在不同温度和时间条件下的热稳定性。
3.2.1  温度对β-淀粉酶热稳定性的影响
由表1可知，在2%的初始淀粉浓度条件下，随着温度的升高，β-淀粉酶的热失活明显加快。在30℃的120 min内，β-淀粉酶活性没有衰变；在40和45℃的反应时间超过40 min后，β-淀粉酶的活性开始衰变；当培养温度超过50℃时，酶活丧失速率明显加快。该结果表明，底物的保护不能有效地保护酶的热稳定性，温度控制是防止酶热失活的唯一可行性方法。据此，使用β-淀粉酶时，工业上应将该酶的应用温度控制在40℃以下。
表1温度对酶热稳定性的影响
Time30o C40o C45o C50o C
/ min A1110A12m1A2110A22m2A31  10A32m3A4110A42m4 010.7145.6710.7145.6710.7145.6710.7145.67 2024.388.0069.8526.749.8172.2026.699.3573.9422.249.1355.91 4027.868.8681.0232.8413.4882.5632.8914.3379.1524.1212.0751.39 6030.3811.1582.0031.6118.5555.6929.5717.6750.7525.1316.8735.22 8035.6816.0883.5830.8120.3044.8226.7917.8838.0024.8717.1033.13 10036.1016.4483.8429.7420.6938.5926.2017.9735.1023.5317.2726.70 12036.3216.8183.2029.3621.0935.2722.7818.1219.8721.7117.3918.42
条件：酶培养在不同温度的pH 4.5、2%的可溶性淀粉的缓冲溶液中；A i1代表用于测定0.2345μg 酶活力的10mL溶液中的还原糖量；10A i2代表0.8mL反应混合物中的含糖量；m i代表酶活力. 3.2.2  底物浓度对β-淀粉酶热稳定性的影响
图1表明，在淀粉中的β-淀粉酶活性和热稳定性明显高于无淀粉的酶，并且高浓度淀粉对于防止酶的热失活有帮助。在无底物的情况下（pH 4.5，45℃），10 min 内，β-淀粉酶的活性衰减一半；30 min内，
酶活丧失83%；50 min后，酶活完全丧失。然而在同样的培养条件下，该酶培养于5% (V/V) 的可溶性淀粉溶液中80 min，其活性基本不丧失，这说明高浓度的底物对延缓β-淀粉酶的热失活可以起到一定作用。该结果与文献[10]报道淀粉的保护能提高β-淀粉酶的稳定性的结果一致。这可能是活性位点与底物的连接提高酶的热稳定性［16］。当反应时间超过80 min 后，酶的热失活明显加速。导致该现象发生的原因如下：其一，底物浓度的减少会弱化或丧失淀粉对酶的保护；高温加剧了不可逆的酶失活现象发生。因此，底物的保护不可
能从根本上克服酶的热变性，温度控制是使酶活有效发挥的最好手段。
3.2.3  钙离子加入量对酶热稳定性影响
由图2不难得出，钙离子的加入量直接关系到β-淀粉酶的催化效率，当CaCl 2的添加量在0- 34 μmol / μg 蛋白时，随着CaCl 2的用量加大，β-淀粉酶的活性和热
稳定性有显著的提高。当CaCl 2的浓度为34 μmol /μg 蛋白时，其活性和热稳定性达
到最大值。当CaCl 2的加入量在34- 68 μmol / μg 蛋白时，随着CaCl 2的用量加大，β-
淀粉酶的活性和热稳定性迅速下降。当CaCl 2的加入量在68- 136 μmol / μg 蛋白时，
β-淀粉酶的活性和热稳定性与不加钙的情况相似。因此，选择合适的钙量直接关系到β-淀粉酶的催化效率，该结果与文献［5,7］报道β-淀粉酶的活性和热稳定性不需要钙来维持的结论不一致。Díaz 等通过向pH 5.5的溶液中加EDTA 观察对β-淀粉酶的活性无影响的现象，得出β-淀粉酶的活性和热稳定性不需要钙来维持结论根本上不科学。事实上，在pH 5.5时，EDTA 对Ca ２＋是一种弱的鳌合剂[17]。因此，EDTA 的加入对β-淀粉酶的活性无影响，并不能进一步说明β-淀粉酶的活性和热稳定性不需要钙来维持的论断。
E n z y m e  a c t i v i t y  / ( U  / u g  p r o t e i n  )Tim e / ( m in )
E n z y m e  a c t i v i t y  / ( U  / u g  p r o t e i n  )Tim e / ( m in )
图1  淀粉浓度对β-淀粉酶热稳定性的影响        图2  Ca 2+用量对β-淀粉酶热稳定性的影
响
条件：pH 4.5, 45o C ；a: 0%; b: 1%; c: 2%; d: 5%            条件：pH 4.5, 45o C ；1: 0%; 2: 17mM Ca 2+ 3: 34mM
Ca 2+; 51 mM Ca 2+; 68mM Ca 2+
3.2.4  不同的培养条件对酶的热稳定性影响
图3表明，CaCl 2的添加量对提高β-淀粉酶的活性和稳定性是有利的。当处于淀
粉中的β-淀粉酶加入34 μmol CaCl 2 / μg 蛋白时，该酶的水解效率与不加钙相比提
高1.25倍；与原酶相比，培养在34 μmol CaCl 2 / μg 蛋白中的酶，其热稳定性好，
而前者则表现出衰变的迹象。这些都说明合适CaCl 2的添加量对防止β-淀粉酶的热

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