安徽科技学院学报,2021,35(1):1-9
Journal  of  Anhui  Science  and  Technology  University
0-内酰胺酶的活性检测和抑制研究进展
丁 阳，吴琼*，李林*
(南京工业大学先进材料研究院，江苏南京210000)
摘 要：-内酰胺类抗生素是20世纪的伟大发明之一，拯救了数以万计生命。然而，随着抗生素临床应用 的普及，由—内酰胺酶导致的致病菌耐药性问题也日益突出。耐药菌的进化和传播严重影响到人类健康 和全球社会经济发展。因此，检测/抑制0内酰胺酶的活性对合理使用抗生素、有效感染类疾病具有 重要意义。目前，特异性检测、抑制！内酰胺酶的相关方法和临床应用已有报道。本综述主要阐述细菌产 生-内酰胺酶的耐药机理，总结近年来！内酰胺酶荧光探针和抑制剂的发展，以期为今后设计特异性高、 灵敏度强的该类荧光探针和抑制剂提供理论依据，解决抗生素耐药性问题。关键词：-内酰胺酶；耐药菌；抗生素；荧光探针；抑制剂
中图分类号:R1文献标志码:A 开放科学(资源服务)标识码(OSID):
文章编号：16738772(2021)01000109
reaction研究DOI ：10. 19608/j. cnki. 1673-8772. 2017. 0913Recent  Progress  in  Detection  and  Inhibition  of  the  Activity  of  p-Lactamase
DING  Yang, WU  Qiong * , LI  Lin *
(Institute  of  Advanced  Materials , Nanjing  Tech  University, Nanjing  210000, China)
Abstract :Lactam  antibiotics  are  generally  perceived  as  one  of  the  greatest  inventions  of  the  20th  centu ­ry, and  these  small  molecular  compounds  have  saved  millions  of  lives. However, upon  clinical  applica ­tion  of  antibiotics, the  0—lactamase  secreted  by  pathogenic  bacterias  can  lead  to  the  gradual  development  of  drug  resistance. As  a  result, detecting  and  inhibiting  the  activities  of  -lactamase  are  of  great  value  for  2heraionaluseofanibioicsand2he2rea2men2ofinfeciousdiseases1A2presen2(manyspecificde2ec- ionm
e2hodsandinhibiorsof  -lac2amasehavebeendevelopedandappliedinclinicalpracice1In2his  review (we  describe2he  resis2ance  mechanism  of  bac2eria  producing  -lac2amaseandfur2hersummarize  2hefluorogenicprobesandinhibiorsof  -lac2amase  1I2may  be  valuable2o  design  fluorogenic  probes  wihimprovedseleciviy (sensiiviy (ande f eciveness2ofur2heridenify2heinhibiorsfor  -lac2amases  andeven2ua l yovercomebac2erialresis2ance1
Key  words : 0-Lactamase; Drug-resistant  bacterias; Antibiotics; Fluorogenic  probes; Inhibitors
收稿日期：2021-01-02
基金项目：国家自然科学基金项目(81672508)；江苏省研究生科研与实践创新计划(KYCX-1056) +作者简介：丁阳(1996 — )男，安徽合肥人，硕士研究生，主要从事小分子荧光探针对蛋白质尖性的检测与调控研究+通信作者：吴琼，副教授,E-mail : iamqwwi @njtech. edu. in ；李林，教授,E-mail : iamlli @njtech. edu. cn
o
2安徽科技学院学报2021年
1背景
抗生素的诞生在现代医学发展史上具有里程碑的意义，也是最成功的药物之一+这些小分子化合物在感染性疾病的中发挥着重要作用，挽救了数百万人的生命⑴+常用的抗生素包括'内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类和大环内酯类等2。'内酰胺类为最典型、最常见的抗生素，其临床医疗使用率超过50%%&。如图1所示，常见的内酰胺类抗生素根据结构特点可分为青霉素类、头抱菌素类、碳青霉烯类和单环类等4类%不同的药物结构对应独特的抗菌谱（-内酰胺抗生素的选择取决于实际临床感染疾病的病因和严重程度%&+'内酰胺类抗生素含有的内酰胺四元环是药物发挥活性的重要药效基团（旦四元环的键角小、环张力大等特点容易受其他因素的影响，发生开环，失去药物活性%&+
抗生素的滥用，导致部分致病菌产生了'内酰胺酶，最终产生对抗生素的严重耐药性，降低了抗菌药物疗效+'内酰胺酶是一种水解酶，能破坏'内酰胺类抗生素的'内酰胺四元环，使药物失效%0&+自20世纪40年代首次发现！内酰胺酶以来，到2018年为止已鉴定出近2800种类型的'内酰胺酶%叮+ 2018年，世界卫
生组织（WHO）的全球抗菌素监测系统（GLASS）显示，全球22个国家由于抗生素耐药导致的感染约有50万人%2&+针对不断进化和传播的内酰胺酶，科研人员开发了一系列特异性检测和抑制酶的活性的方法⑷+荧光探针是'内酰胺酶检测和监控的重要诊断工具%5&+同时内酰胺酶抑制剂可以保护抗生素的药物活性免受'内酰胺酶的水解。目前临床常用的'内酰胺酶抑制剂包括克拉维酸钾、舒巴坦和他唑巴坦+然而，随着！内酰胺酶的不断变异，耐药菌的威胁与日俱增。因此，有必要明确内酰胺酶产生活性的关键信号分子，探索新的临床检测方法和抑制剂，应对日益恶化的耐药情况。
2卩・内酰胺酶的水解机理和分类
'内酰胺酶特异性产生于细菌中，可与青霉素结合蛋白（PBPs）结合并进行酰化，在抗生素到达适合的靶向位点前将其水解，从而使抗生素失活。内酰胺酶的产生既可以通过染体编码，如铜绿假单胞菌；又可以通过质粒传播，如嗜水气单胞菌、金黄葡萄球菌等%8&+大约有80%耐药菌的耐药类型都与!内酰胺酶有关%9&+如图2所示的青霉素水解过程（-内酰胺酶首先与抗生素形成非共价的Michaelis复合物，然后酶的空腔中丝氨酸的游离羟基入侵'内酰胺四元环（形成共价的酰基酯并破坏四元环（使得抗生素与'内酰胺酶形成了稳定复合物。酶在水分子的进攻使下脱落，最终形成没有药物活性的抗生素和恢复了活性的'内酰胺酶20+
Ser-bla
青霉素Michaelis复合物
图2!■内酰胺酶与青霉素反应的水解机理
Fig.2Hydrolysis mechanis m for penicillin reacting with0-lactamase
根据氨基酸的同源性内酰胺酶最常见的是通过Ambler分类法分为A、B、C和D4类。其中A、C
第35卷第1期丁卩日，等：'内酰胺酶的活性检测和抑制研究进展3
和D类内酰胺酶的催化中心是丝氨酸,B类内酰胺酶的催化中心是金属离子，属于金属类'内酰胺酶™+通过底物类型也可将'内酰胺酶分为青霉素酶、头抱菌素酶、超广谱'内酰胺酶和碳青霉烯酶。Bush分类法是通过水解底物的特异性和对克拉维酸的敏感性对'内酰胺酶分类22+如今，由于细菌的迅速传播和'内酰胺酶的基因突变使耐药菌引起的感染和疾病越来越难以[2324]+
3卜内酰胺酶的检测
目前内酰胺类抗生素耐药性的检测方法主要包括表型、基因和酶学检测。表型检测即检测细菌对!内酰胺类抗生素的敏感性，包括琼脂扩散试验、最低抑菌浓度(MIC)试验、双盘协同试验(DDST)和改良霍奇试验(MHT)(I)2'8。基因检测方法主要通过聚合酶链反应(PCR)进行a。实时定量逆转录酶可以检测细菌耐药
基因的定量表达。质谱和氢谱也被用于检测内酰胺酶耐药菌%031&+近年来，生物环境内的标志物识别与检测已成为化学和生物学领域的重要研究课题之一。
3.1不同报告基团的探针
1998年Zlokarnik等％2&首次报道了一种基于头抱菌素结构的荧光探针(CCF2/AM)如图3a所示，该探针通过荧光共振能量转移(FRET)原理成功监测了'内酰胺酶活性。酶水解CCF2后，香豆素发出蓝荧光。由于FRET探针依赖于相对复杂和庞大的分子结构，降低了其进入细胞后与标记物反应的效率，因此2003年,Gao等%3&开发了新型的小分子荧光底物CR2/AM，用于'内酰胺酶的活性检测。如图3b所示，在酶的作用下，头抱菌素类荧光底物释放出试卤灵染料。该底物表现出对'内酰胺酶优秀的特异性和灵敏度，可检测和成像C6胶质瘤细胞中的'内酰胺酶活性。
细胞成像
C6神经胶质瘤细胞
图3(a)CCF2/AM与！内酰胺酶的反应过程.(b)CR2和K内酰胺酶的反应过程;
CR2/AM在野生型(I)和转染K内酰胺酶的C6神经胶质瘤细胞(II)中的细胞成像
Fig.3(a)Reaction process of CCF2/AM with R-lactamase；
(b)Reaction process of CR2and bioimaging of CR2/AM incubated
(I)wild-type and((I)Bia stably transfected C6glioma cells
然而(这种小分子荧光探针短的吸收和发射波长(限制了其在活体成像中的应用+近年来，近红外光谱在化学生物学领域引起了广泛的关注。其具备较长的激发/发射波长，产生的自荧光背景较少，损伤较小，组织穿透性较高，在生物成像中显示出良好的应用前景。2005年,Xing等%4&基于FRET设计出一系列近红外探针CNIR，检测C6神经胶质瘤细胞中的'内酰胺酶。如图4a所示,Cy5.5通过氨基乙酰基连接到头抱菌素的氨基基团上,QSY21通过四氨基噻吩和半胱氨酸连接到头抱菌素的3/位点上，通过乙酰化在母核上引入氨基葡萄糖类似物(曾强探针在C6胶质瘤细胞中的检测稳定性。CNIR在C6胶质瘤细胞中的'内酰胺酶具有良好的检测能力和实时成像功能。2014年,Li等%5 * *&将头抱菌素与半花青素染料
4安徽科技学院学报2021年
结合，开发了一种高灵敏度的近红外荧光探针(Probe1)检测金黄葡萄球菌中的0-内酰胺酶，如图4b所示。与CNIR相比,Probe1不仅分子结构更简单，而且具有更好的光学性能。
金黄葡萄球菌
ATCC BAA44,Bia(+)ATCC11632,Bla(-)ATCC29213,Bla(-)
图4(a)CNIR的结构,CNIR4在野生型(I)和转染0-内酰胺酶的C6神经胶质瘤细胞(II)中的细胞成像；
(b)Pobe1与P内酰胺酶的反应过程;Pobe1在不同金黄葡萄球菌中的成像：(III)ATCC BAA44；(IV)ArCC11632；；V)ATCC29213
Fig.4(a)Structures of CNIR and bioimaging of CNIR4incubated(I)wild-type and Bia((I)stably transfected C6glioma cells；
(b)reaction process of probe1and bioimaging of different S.aureus strains:
((II)ATCC BAA44,(IV)ATCC11632,(V)ATCC29213loaded with probe1
3.2不同特异性的探针
以上报道的探针结构设计均基于第一代头抱菌素。然而由于0-内酰胺酶的进化，第一代头抱菌素会被所有类型的0-内酰胺酶水解，因此根据第一代所设计的探针也会与所有类型的0-内酰胺酶反应，不具有选择性。2012年,Zhang等％6&基于FRET机制在第三代头抱菌素头抱噻肟的基础上设计出检测ESBLs 的对照组荧光探针C-1和C-20如图5(a)所示，通过对比发现，在头抱菌素核心空间位阻较小的探针能被0-内
酰胺酶TEM-1快速水解，而C-2水解非常缓慢。该方法在一定程度上可以防止抗生素的一些不合理使用。2017年,Aw等%7&通过在头抱菌素母核的7位上引入一个大的位阻甲氧巯基，设计了一种用于检测AmpC的特异性探针ERM-10如图5b所示,ERM-1利用聚集诱导发射(AIE)机制选择性荧光标记AmpC，并直接观察到耐药菌生物膜的形成+
所有金属类0-内酰胺酶都属于碳青霉烯酶。2008年，新德里金属类0-内酰胺酶(NDM)的出现将碳青霉烯耐药细菌的研究推向了高潮％8&+碳青霉烯酶对碳青霉烯类抗生素构成严重威胁，几乎可以水解所
有0-内酰胺类抗生素。因此，有必要设计和合成能够高选择性检测含碳青霉烯酶病原体的试剂％9&。Rao 等%&根据碳青霉烯类抗生素的6，反式结构，将头抱菌素母核上的顺式结构转化为反式结构设计了系列探针(S)-CC，首次实现了选择性检测肠杆菌科中的碳青霉烯酶，如图6(a)所示。然而，探针(S)-CC荧光染料的发射波长短，检测灵敏度低等限制了在临床上的应用。2017年,Xie等受(S)-CC结构的启发，合成出能够准确、快速、稳定地鉴定碳青霉烯酶的底物，同时利用BODIPY作为荧光染料设计出具有良好的光学性质和临床应用前景的探针CB-1%1，如图6(b)所示。
第35卷第1期丁卩日，等：'内酰胺酶的活性检测和抑制研究进展5
(b)
图5(a)探针C-1和C-2的结构；(b)探针ERM-1的结构和与AmpC的反应过程
Fig.5(a)Structures of probe C-1,C-2；
(b)Structure and the process of probe ERM-1reaction with AmpC
碳青霉烯酶
坏+瞰°
水解开环
O^OH
(S；-CC-1:R=Me fS)-CC-2:R=Et(S)-CC-3:R=/-Pr fS)-CC-4:R=f-Bu(S)-CC-5:R=Bn咼-CC-6:R=p-Ts
图6 (a)探针(S)-CC的设计路线和被碳青霉烯酶水解的过程；(b)碳青霉烯酶特异性探针CB-1的设计路线
Fig.6(a)Design route of(S)-CC and the process of their hydrolysis by carbapenemase；
(b)Design route of carbapenemase-specific fluorogenic probe CB-1
4卩・内酰胺酶抑制剂
'内酰胺酶抑制剂能够抑制导致细菌产生耐药的'内酰胺酶活性。它与'内酰胺类抗生素联合使用，以保护其不被水解，从而有效地对抗耐药细菌。Drawz和Bonomo总结了过去30年里'内酰胺酶抑制剂的研究[23]+目前，商业'内酰胺酶抑制剂主要由克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦和阿维巴坦克拉维酸主导，前三种
均为！内酰胺酶经典抑制剂，其结构如图7所示。这些经典的！内酰胺酶抑制剂与'内酰胺酶发生不可逆反应，形成共价化合物，在临床上经常与抗生素联合使用％2&+
克拉维酸舒巴坦他哩巴坦
图7三种经典的！■内酰胺酶抑制剂
FigH7StructuresoPthreeclassicalinhibitorsoP-lactamase

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