第40卷第5期
2021年5月分析测试学报FENXI  CESHI  XUEBAO  (Journal  of  Instrumental  Analysis )Vol. 44 No. 5617〜627
doi : 10. 3969/j. issn. 1004 -4957. 2021. 05. 001
食品安全快速检测专栏I
编者按：“民以食为天，食以安为先”目前食品市场空前繁荣，食品安全问题也随之
而来，引发了大众的关注和担忧。
但食品(特别是农产品)属于快消品，常规检测方法往往难以有效快速辨别有害物，
起不到保护消费者健康的作用。2215年颁布的《食品安全法》鼓励基层用符合要求的快速 检测方法进行有害物筛查，从源头保障消费者健康。食品安全快速检测技术具有操作简单，
成本低廉，灵敏度高，检测快速等优势，满足大批量样品快速检测的需求，在非法添加剂、
激素、致病菌、农兽药残留、生物毒素、重金属及有毒化合物等食品检测领域得到了广泛 应用。
本刊特邀西北农林科技大学的王建龙教授和华南农业大学的徐振林教授策划了 “食品
安全快速检测”专栏，组织高质量约稿9篇，充分展示了 “快检”技术在食品安全检测领 域的相关应用。
食源性致病菌快速检测方法研究进展
姚帮本闫 超5，姚 丽2，陈赵然5*
*，陈 伟2*收稿日期：2222 -12-22；修回日期：：。？)-。？-)
基金项目：市场监管总局科技计划项目(2929MK949)；安徽省博后科研活动经费资助项目(2222B412)；安徽省市场监管局科技计划
项目(2919MK937)
*通讯作者：陈赵然，硕士，工程师，研究方向：食品安全检测技术研究，E-maP ： ***************
陈 伟，博士，教授，研究方向：食品安全快速检测，E  - maP : ******************
(5.安徽省产品质量监督检验研究院 安徽 合肥230055； 2.合肥工业大学
食品科学与生物工程学院安徽合肥230009)
摘 要：食源性致病菌污染是导致食品安全问题的重要因素，食源性致病菌的检测已成为近年来研究的热 点。以免疫分析、分子生物学、生物传感器、代谢组学、核酸适配体等技术为基础的快速检测方法发展迅 速，已成为检测食源性致病菌的主要方法。该文结合近年来各种快速检测方法的相关研究进展，介绍了以上 述技术为基础的快速检测食源性致病菌的方法，并讨论了现有方法存在的问题和未来的发展方向，以期为食 源性致病菌的防控和保障消费者身心健康提供借鉴。
CDE ： 食源性致病菌； 快速检测； 免疫分析； 分 生物学
中图分类号：O657.3 文献标识码：A  文章编号：1504 -4957(2021)05 -0617 -15
Advance  ou  Rapid  Detectiou  oI  FooUboran  Pathogenic  Bacteria
YAOBang-ben 1，，YANChao 1，YAOLi 2，CHENZhao-ran 1 *，CHEN  Wei 2*
(1. Antra  Province  Prodrct  Quality  S upervision  and  Inspection  Institute ， Hefed  230051， China ； 2. School  of  Food  Science
and  Biolouicai  Enaineerina ， Hefet  University  of  Technoloey ，Hefet  230009， China)
Abstract : The  contdminpion  of  fooUdornc  ppUouenic  Oactene  it  an  idpoUdnt  factoo  leapinn  tu
safeta  problemt. The  detection  oI  fooddome  edtUoeeeic  Oactene  hnt  become  n  nseenh  hotspoi  in
ceei  yen. Rdpin  detection  皿£止0& baseC  cm  immcnoassny ， molechlav  biolony ， biosecsora ， metdnolomics , c C  nncOic  ncin  dptdmen  hnva  beec  develoninn  mpiedy, c C  hnva  become  the  main  detection  皿6止0& fov  foondome  patUoaen2e  bactene. CombineC  with  the  msecmh  pmamss  of
rapin  detection  methona  in  mcent  yeera ， U l IC  rapin  detection  methona  fov  foonbome  pathoaena  baseC  on  the  aPova  - mentionen  technoloaiea  a ro  introUpcen  in  this  anicie. Meenwhiie ， the  existinn  pmnr
lema  p C  futcro  dCopment  directiona  aro  also  dischssen. Ii  io  anticinateC  tu  pmene  a  reference  fov  the  preventiou  ant  coutrot  of  foondorne  pathoaena  ant  the  protectiou  of  consomers  ppysichi  ant  mentU
618分析测试学报第40卷
reaction研究health.
Key words:foodborna pathogeaic bacteria；rapid detection；immunoassay；molecular biology
“民以食为天，食以安为先”，食品安全关乎着人们“舌尖上的安全”，直接影响人民众的身体生命安全。食品安全问题是指生物学性等因素成品各食品来的潜成的。因素主要食源性致病微生物、、重、真菌素污染、、以及食品的成分。食源性致病菌污染是导致食源性疾病的主要原因，美国每年都有约480万例食源性疾病患者（相当于六分之一的美国人），约12.8万人住院和3000人死亡⑴。目前常见的食源性致病菌主要黄葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌、致病性弧菌、弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽抱杆菌和阪崎肠杆菌等⑵。常规的检测方法主要有平板分离法、化学分析免疫分析。但这些方或多或少存不足，如步骤繁琐、检测周期长、成本高、对操作人员的专业水平要求高。因此，开发简单、灵敏、快速和低成本的检测复杂食品样品中致病菌的方法成为迫切需求。
本文综以免疫分析、分子生物学、生物、学、为的快速检测食源性致病菌的方法，阐各方法的原理、优缺点和应状等，快速检测方的问题来的发展方向，以期为食源性致病菌快速检测技术的发展参考，对各学科研究和食品安全监管具定意义。
1食源性致病菌快速检测方法
1.1免疫学检测技术
1.1.1酶联免疫吸附测定技术酶联免疫吸附测定宀3（Enzyme-imaed immunosorbent cscy,ELISA）技术是将抗原与抗体反应和酶化学反应结合起的测定技术，具有灵敏度高、快速、特异性强的特点，所需程度低，样本前处理相对简单，特场监大量样本。
Zhci等细胞技术7株阪崎杆菌单抗体，立的间接竞争酶联免疫吸附测定法对阪崎克罗诺杆菌的检测灵敏度可达16CFU/mL。Fen等⑸利用双抗夹心ELISA法对大肠埃希氏菌0157:H7进行了检测（示意图见图1），结果表明，该方法在105〜108CFU/ mL范围内具有良好的线性关系，灵敏度达1x104CFU/mL。此外，经过8h的增菌，该方法对人工污染的样品中大肠氏菌0157:H7的检测灵敏度达到0.8CFU/y。
图1双抗夹心ELISA法原理示意图
Fig.1Sandwich ELISA principtc bi a y r am
1-1-2免疫层析技术免疫层析（（mmuno chromatography，IC）技术的检测原理是将目标物的特异性抗定 素，然后目标物细管层析的作样品区向素，在经过定特异性抗的，抗抗生特异性免疫反应，目物定特定的，
后、或、酶促反应显等方定检测结果。该项技术操作方便，结的时间的只需3〜5min，最长不33min。高度特异的抗原抗体反应可该检测结持很高的特异性和灵敏度。一般只需不到10^L样本即可得到检测结果。产品只需室温保存，有效期长，，强，专业人员也可以操作。
Hassaa等⑹首次使用单克隆抗体荧光横向流动免疫分析法检测了牛肉中的大肠杆菌0157:H7，这种新方法的灵敏度是传统横向流动分析方法的数千倍，在牛肉中的检出限为18CFU/y。此外，该方法的检测成本方法低66%，且结果可。Lio等⑺建立检测水产品和性弧菌的免疫析方，该方性弧菌高的特异性敏性，检出限为1.2x103CFU/mL，对32株目标菌、13个白虾和146个腹泻患者粪便样本的敏感性和特异性检
第3期姚帮本等：食源性致病菌快速检测方法研究进展619
测率均为100%。Qi等［4］将免疫磁性纳米颗粒与免疫层析技术相结合，建立了一种快速、高灵敏检测大肠埃希氏菌0157:H7的方法，灵敏度从13CFU/mL提高到13CFU/mL。吴颖等⑼开发了一种检测金黄
葡萄球菌的胶体金免疫层析试纸条方法，将一种金黄葡萄球菌蛋白A(SPA)的单克隆抗体连接胶体金，通过另一株SPA的单克隆抗体包被硝酸纤维素膜，制备双抗夹心法胶体金免疫层析试纸条，灵敏度达1X106CFU/mL。Chen等使用末端功能化的引物对目标基因进行扩增，开发了一种基于量子点的快速、高敏检测金黄葡萄球菌的免疫层析试纸条方法，在奶粉和肉类样本中的检测限分别为3x IO0CFU/mL和3x101CFU/g。Noguera等［11］用碳纳米粒子标记中性抗生物素蛋白，利用双修饰的特异性引物进行扩增，建立了一种可以针对大肠杆菌不同基因的免疫层析试纸条检测方法，灵敏度达lO^lO3CFU/mL。
1.1.3免疫荧光技术免疫荧光技术((mmunoUuorescence technique,IFT)通过将不影响抗原抗体活性的荧光素标记在抗体(或抗原)上，使之在与其相应的抗原(或抗体)结合后，于荧光显微镜下呈现特异性的荧光反应。目前普遍使用的荧光素是免疫荧光微球和量子点。使用荧光素标记的抗体作为特异性免疫荧光探针，通过与致病菌结合复合物的荧光强度变化可实现致病菌的定量检测［12］。
免疫荧光技术具有发射波长可控、光稳定性好、快速、灵敏度高等特点，还可与其他技术相结合进行食源性致病菌的检测。Xue等将免疫磁性纳米粒子和免疫量子点相结合，对大肠杆菌0157: H7进行定量检测，2h内即能检测到低至14CFU/mL的大肠杆菌0157:H7。MitcheC等冋应用量子点标记技术检测大肠杆菌0157:H7，检测限为49xl5-15mol/g o Hu等［15］采用量子点进行荧光标记检测金黄葡萄球菌，检出限为13CFU/mL，该方法的样品不需进行预处理与增菌，可直接进行检测，整个检测时间约为3h0此
外，法国梅里埃公司的全自动免疫分析仪(VIDAS)的原理即是基于酶联荧光免疫分析技术：包被了固相抗体的固相吸附器捕获样品中目标菌的特异性抗原，随后碱性磷酸酶标记的二抗再与目标菌的特异性抗原结合，二抗连续的碱性磷酸酶将底物水解，产生的磷酸-4-甲基伞形酮在377nm下能够产生荧光，将测定的荧光强度与设定阈值的大小进行比较，若高于阈值则判断结果为阳性，低于阈值贝9判断为阴性。王似锦等［16］采用全自动免疫分析仪对保健食品中沙门氏菌进行检测，检验时间可以缩短至44h0
1.1.4免疫磁分离技术免疫磁分离技术(Immunomagnetic beaPc separation techniquec，IMBS)作为食品样品有效的预浓缩技术，能够快速地从复杂食品基质中选择性分离和浓缩靶细菌。其主要原理是超顺磁性颗粒表面经化学修饰后，与靶细菌特异性的活性蛋白质结合制成免疫磁珠((mmunomagnetic beads,IMBs)，然后IMBs上的抗体将会特异性识别与捕获待检样品中的目标菌，形成IMBs-目标菌复合物。最后依靠磁场的作用力快速地使复合物与样品中其他杂质分离，从而达到高效、精准浓缩目生物的目的。
免疫磁分离技术具有特异性强、灵敏度高、分离速度快的特点［5"4，可与多种其他技术相结合达到快速检测食源性致病菌的效果。Chen等［15］采用免疫磁分离技术和PCR相结合的方法检测婴幼儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌，检出限达52CFU/mL，检测方法灵敏、快速。Zeng等建立了一种免疫磁分离-环介导等温扩增(IMS-LAMP)技术检测牡蛎中副溶血性弧菌的快速方法，该方法特异性良好，经4h前增菌后，最低检测限达到0.19CFU/g，检测时间缩至24h。寇晓晶等将免疫磁分离技术和ATP发光技术联合用
于沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄葡萄球菌的快速检测，与传统的细菌培养方法有良好的线性相关性，检测限低至152CFU/mL。Huang等将免疫磁分离技术与荧光纳米针横向流动相结合检测生乳中的大肠杆菌0157:H7。使用免疫磁分离技术后，荧光纳米针横向流动试纸条的荧光信号值增强，说明免疫磁分离技术可富集大肠杆菌0157:H7并减少食品基质的干扰。
免疫学检测技术是以酶标记的抗体(或抗原)为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性相结合的一种免疫方法，对标记用酶具有特定要求，如活性高、纯度高等；对相应的标记物也有特定要求，如荧光标记物需荧光效率高，与蛋白质结合稳定，易于保存等。免疫技术受灵敏度和精确度的限制，一般用来对大量样本进行初筛，最终精准定量需要借助仪器确认。
1.2分子生物学检测技术
分子生物学是从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学，其发展始
620分析测试学报第46卷
于COch和Watson^3在1953年提出的双螺旋结构，标志着现代分子生物学的兴起。分子生物学技术具有高灵敏度和特异性，被广泛用于食源性致病菌的检测。常用的分子生物学检测方法有聚合酶链式反应（Polymerasa chain reaction，PCR）、多重PCR（mPCR）、实时定量荧光PCR（qPCR）、数字PCR和基因芯片等。
1.2.1PCR技术PCR技术是最早发展起来的分子生物学检测技术，是以变性、退火、延伸为周期循环进行的体外DNA扩增的过程，可在短时间内使目标基因成倍增加，扩大检测对象的数量，从而提高检测灵敏度。
Rahn等皿在1992年第一次设计了一对沙门氏菌mvA基因的弓|物来检测沙门氏菌，采用此方法检测了100多个血清型的630株沙门氏菌，对照组由21属细菌的142个非沙门氏菌菌株组成。结果仅有4株未检出，检出率为95.8%0Pinto等口7将PCR技术和ELISA技术相结合，对贝类中副溶血性弧菌的一个特异性基因进行扩增，使用生物素标记的寡核昔酸探针捕获（DIG）标记的PCR产物，用ELISA方法进行检测，灵敏度较普通PCR产物的琼脂糖凝胶电泳提高了10倍°PC R技术灵敏度高、特异性强，但易受污染，且无法对检测过程中出现的死亡菌株进行识别，因而可能出现假阳性条带。
PCR技术也是食源性致病菌快速检测的常用方法。但该方法的扩增结果不能肉眼直接识别，需要借助凝胶电泳等方法进行表征，在定量丰度低的不可培养微生物时的准确性不强。
1.2.2多重PCR技术多重聚合酶链式反应（Multiplee polymerasa chain reaction，mPCR），是在传统PCR的基础上，在同一个PCR反应体系中加入多对特异性引物和模板（引物与相对应的模板特异性结合）同时扩增出多个不同序列的DNA片段。在同一反应体系中扩增多个DNA片段，可同时检测多种食源性致病菌，减少实验操作次数、缩短检测时间、节省试剂。
杨国兴等［22］选取金黄葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌SipB基因、志贺氏菌ipaH基因和单增李斯特菌int基因作为目标基因，设计了4对PCR引物，建立并优化了多重PCR反应体系，评价了该体系的特异性和灵敏度，并对人工污染的熟肉样品进行检测。结果显示构建的多重PCR方法特异性强、灵敏度高，人工污染熟肉匀浆中4种致病菌的检出限为103CFU/mL。熊苏阴等［27］选取金黄葡萄球菌的耐热核酸酶基因（nuc）、沙门氏菌的正转录调节蛋白基因（hit）、大肠杆菌0157:H7鞭毛基因（flic）、单核细胞增生李斯特氏菌的毒力调控蛋白基因（p OA）及霉菌18S rRNA基因V7区，分别设计了5对特异性引物，并对PCR扩增反应体系和扩增条件进行优化，确定获得特异性良好的PCR扩增产物。随后在37七下对人工污染致病菌的香肠、面包和豆腐进行增菌培养，5种致病微生物在22h内的检出限均可达到1CFU/25eo Yang等闯将多重PCR与膜芯片技术联用，可同时检测非预包装即食食品中5种食源性致病菌，综合检出限达0.01n核酸样本。
多重PCR技术适合检测症状相同或易污染相同食品的多种食源性致病菌，可使食品中微生物的检测实现标准化。由于多对引物在同一体系中进行扩增，各对引物之间相互影响，因此多重PCR实际操作过程中的扩增效果和实际扩增的片段数目往往不尽如人意。
1.2.3实时荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR（Real-tine quantitative PCR，qPCR）是在PCR体系中加入荧光标记的探针或荧光物质，并通过仪器实时监测整个PCR扩增过程中荧光信号的积累，最后通过标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析的方法。
Nahin-Davis等卩9采用qPCR方法，以6个靶基因快速检测肠道沙门氏菌，对239个家禽设施中的样本进行测定，结果表明qPCR和普通培养方法在结果上呈现出良好的一致性，且qPCR方法比普通培养方法更省时。目前市面上有一种新型干燥型荧光PCR检测试剂盒［3］，可对副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌0157:H7和单增李斯特菌进行检测，该试剂盒干燥后不影响酶的活性，可常温运输保存、运输，对上述3种食源性致病菌的检测灵敏度分别为144、380、7900CFU/mL，与常见品牌试剂盒效果相当。此外，Alia等［31］开发了一种独特的四重实时定量荧光PCR方法，该方法能够区分加工肉制品和即食肉制品中4种血清型的单核细胞增生李斯特菌，具有高灵敏度、高特异性和快速的特点，对于识品工程单细胞增生李斯特菌的污染来源食品性菌的病学监测
有意义。张叙鑫等「玛用实时荧光PCR法和国标法对采集的66件畜产品、水产品和乳及乳制品中的沙门氏菌、黄葡萄球菌、单细胞增生李斯特菌、性弧菌同检测。结，黄
第5期姚帮本等：食源性致病菌快速检测方法研究进展621葡萄球菌检测结果均为阴性外，其他3种致病菌2种方法均有检出，但实时荧光PCR 法的阳性率均 高 。
qPCR 是一项融合了多种技术的检测 ，与普通PCR 相比，qPCR 技术的 扩增成，扩增完成后不需
分析，不 少了样品的污染机会， 免了污染造成的假阳性结果，缩 检测时间。具备重复性好、快速、实时性强、灵敏度高、可定量检测的特点，现已成为食源性 致病菌检测的研究热点。但实 定量PCR 技术
实验成本较高，所需
，需要操作人员具有较高的专业技术水平。1.2.4数字PCR 技术 数字9（X2221 PCR ，dPCR ）技术是将qPCR 体系等量均分到相互隔离的大 量（多数大于10 000个）微小的反应单元（ 或 珠）中，且理想状
反应 至多 待测 分子。dPCR 的反应过程与qPCR 相似，扩增后的 分 信号
（表示为“”），或没有荧光信号（表示为“0”），通过泊松分布对荧光信号“0”和“”进行统计分 析，即可实
量的测定。dPCR 不需要建立标准曲线，无需 Ct 值（PCR 荧光信号达到设定阈值 经历的 ）进行浓度比较， 为是 定量的方法［3-7。数字PCR 原理示意图见
图2。微滴式数字PCR （ （Dronlci 出,1 PCR ，ddPCR ）是一种将单个目标DNA 分子分散到多个分离的液 ，经PCR 扩增后， 检测，精确定量DNA  的新方法。在ddPCR 检测
，目标DNA 分子的分 计，这意味着大多数反应要么
目标，要么不包含目标。理想情况下，ddPCR 阳性反应的数量
的模板DNA 分子的数量。0000
0000
0000
OOOO
Positive  reactions Negative  reactons Target  quantification y Sample  partitioned  in  to  many  reactions 图2数字PCR 原理示意图Fig. 2 Principle  diayram  oV  diedal  PCR
马薇等以大肠菌的lacZ 基因为靶基因，建立了一种快速、稳定、灵敏、特异的ddPCR 定量 检测方法，可检 叽单 的大肠菌U c Z 基因组DNA 。方佩佩等［3\ 字PCR 技术建立 性弧菌的快速定量检测方法。结 ，该法检测特异性好，
性弧菌 因组DNA 浓度范围为2〜19 440拷贝/22 ^L ，分析得菌悬液浓度为50〜4. 86 x  IO 7 CFU/mL ，与3M 测试片菌悬液浓度 著性差异；与 PCR 相比，ddPCR 可以 低浓度检测 准确定量。Li
等采用一种ddPCR 方法对苹果汁、牛奶和菠菜洗液中的大肠埃希氏菌0157 : H7和0104 : H4进行 定量检测，在苹果汁中的检 达2 CFU/mL 。邓雪蕾等设计制作 聚二甲基硅氧烷-玻璃的多功 成式ddPCR ：， 性弧菌基因组DNA,
定量，定量的线性范围跨越5个量级，检测结果与理论参考浓度间具
的相关性。字PCR 技术具有高灵敏度、高精确度、高 性和绝对定量的优点，已在稀有突变检测和复杂
样本基因表达检测等方面 泛的应用。1.2.5基因芯片技术 基因芯片（Gecc  chip ，GC ）是一种新型的分子生物学检测技术。GC 通过采用 原位合成或 点样技术将大量DNA 探针有规律地 玻璃 或硅 载 ，然
后与待测标记样品按碱 理杂交，经放射自 、 共聚焦 检测系统等扫描芯片，对杂交信号进行检测分析，获得样品的基因 、基因表达等遗传信息⑷亠2。
近年来， 因 技术对食源性致病菌 检测的研究逐渐增多，Suo 等〔43利用基因芯片与多重PCR 相结合的技术检测了大肠杆菌0157 : H7、沙门氏菌的3个种、空肠弯杆菌以及单核细胞增 生李斯特菌。Day 等［⑷利用悬浮 单核细胞增生李斯特菌 检测， 性微球-抗体偶联物对单核细胞增生李斯特菌 的特异性膜蛋 ，可在24 h| 哈密瓜 沙拉中的单核细胞增生李斯特菌，最低检出限达到100CFU/e 。基因芯片技术的自动化程度高，可一次分析大

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