烟草线粒体DNA的研究进展
07生物高静静
摘要：植物线粒体DNA研究是生命科学研究的热点之一，有关植物线粒体DNA 方面诸多问题的阐明对于了解烟草及植物细胞质雄性不育（CMS）等方面提供重要理论帮助。植物细胞线粒体基因组很大，基因表达系统相当独特，同时线粒体和质体（或叶绿体）两种半自主性细胞器存在着相互作用，因此对烟草及其它植物线粒体DNA的深入研究有助于烟草育种工作相关问题的解决。
关键词：烟草线粒体DNA（mtDNA）细胞质雄性不育
1 线粒体与线粒体DNA。
reaction研究1．1线粒体是真核生物进行呼吸作用的细胞器，不同种类细胞中的线粒体数目差异较大，一般为100～3000个，在一个植物细胞中含有50-100个线粒体，而在一个动物细胞中线粒体数目变动范围比较大，少的仅有50个，多的可达到1000个。在植物细胞中的线粒体参与一系列的代谢过程，如植物体内的线粒体能将细胞合成和吸收的脂肪，糖类等储藏的能量氧化成二氧化碳与水释放出来，再将其存储的太阳能转换成细胞维持自身生理活动的能量-ATP分子。1962年Ris 和Plant在衣藻叶绿体中发现DNA，1963年M. Nass和S. Nass在鸡胚肝细胞线粒体中发现DNA，以后又从植物细胞线粒体中发现了DNA。线粒体DNA （mitochon
drial DNA/mtDNA），又叫线粒体基因组，与细菌DNA相似，也是双链的超螺旋环状分子，一般来说，动物的mtDNA较小，约为16kb，植物的mtDNA 较大，在200 kb（油菜）到2500 kb（西瓜）之间变动。
1．2线粒体DNA可以自我复制，既可以按照半保留方式进行，也可以按照θ型复制方式或滚环复制方式进行。值得注意的是mtDNA的D-loop复制方式，即二条DNA链不同时开始复制，而是一条在前，一条在后，因而在复制进行中生成D环，它是线粒体DNA的非编码区，是线粒体DNA分子中突变率最高的部分。
2 线粒体DNA（mtDNA）与核DNA（nDNA）
现在人们基本了解了线粒体DNA（mtDNA）与核DNA（nD-NA）之间的区别与联系：
第一，与内共生起源一致，线粒体DNA（mtDNA）具有半自主性，并且如果能够重组或至少可以互补的情况下，mtDNA还可以进行合成和分裂功能。
第二，线粒体DNA（mtDNA）具有多拷贝的继承性。
第三，与核DNA不同，线粒体DNA是裸露的，没有结合组蛋白。
第四，复制分离导致了在细胞血统之间的单元型与分配方面有了改变，甚至在相同的双胞胎之间也存在着不同的mtDNA。
第五，线粒体病又称线粒体细胞病，是指线粒体DNA的缺陷所造成的疾病，包括线粒体DNA重复、缺失以及突变。线粒体为细胞内提供能量的细胞器，如果线粒体DNA发生突变，由于突变的线粒体数量增加，导致细胞不能产生足够的ATP，从而造成细胞功能减退甚至坏死。
第六，线粒体DNA大小相对其编码能力显得大大冗余，其中含有大量的非编码序列、重复序列，甚至其它来源的序列。
第七，线粒体DNA的变异速度是细胞核DNA的5-10倍以上。据报导，任何两个mtDNA平均有70个碱基不同。这是由于线粒体基因不象细胞核DNA那样有必要的修复系统，故很容易被自身合成能量时的氧化反应损伤。虽然DNA受损通常导致线粒体机能的丧失，但也促使其产生出许多变异的后代。又因为线粒体DNA可以快速复制，线粒体DNA出现的任何突变都可能迅速扩散开来，其中不乏变异幅度很大，能力超的个体，有利于加快遗传育种的进程。
第八，线粒体由600种以上的蛋白质组成，它可以利用自己的核糖体独立合成蛋白质，并自行分裂繁殖。但事实上线粒体内超过90%的蛋白质（包括线粒体繁殖时复制DNA所需要的酶）必须由细胞核编码，再由细胞质内的核糖体合成后传送到线粒体中。1987年Green在线粒体基因组中到了核DNA基因片段；而在核基因组中Nawa等也发现了线粒体和叶绿体基因片段。高等植物细胞内的三大遗传系统之间存在遗传物质的交换，因此，片面地运用三个遗传系统中某一系统的遗传功能去解释错综复杂的生命现象（如细胞质雄性不育性），显然是不适当的。
3 植物线粒体DNA与细胞质雄性不育（CMS）。
3．1雄性不育性分成细胞核雄性不育、细胞质雄性不育和细胞核质互作雄性不育。高等植物细胞质遗传研究的最重要的实践应用就是细胞质雄性不育（CMS），它在高等植物界普遍存在，是作物优势利用的基础。早在1970年，Edwardson就利用原始的基因分析办法指出了保持系和不育系线粒体DNA存在着
差异。1991年Han-son指出线粒体DNA的某些突变与细胞质雄性不育存在一定的关系。从理论上讲，细胞质雄性不育系经多代回交转育后同保持系在核基因组成上是一致的，雄性不育系和保持系育性的表达差异应该是集中在细胞质中遗传物质的携带者叶绿体DNA（cpDNA）或植物线粒体DNA（mtDNA）上。所以，无论雄性不育源如何，不育的机理都是由于核质不协调引起的，尽管在不同的雄性不育体系中可能有不同的机制。高等植物线粒体基因的编码序列保守性很强，而编码区以外的序列则保守性很低，这个特点有利于利用已知基因研究其它各种植物线粒体基因的多肽性变化，与叶绿体DNA相比，线粒体DNA具有较高程度的多态性，许多作物的线粒体DNA的RFLP限制性内切酶图谱也表现出很高程度的多态性。
3．2近年发展起来的RAPD（randomly amplified polymorphic DNA）及AP-PCR（arbitralily primed polymerase chain reaction）分析技术被应用于雄性不育机理的研究中也愈来愈多，它简单，快速。M.
Lernz等在对甜菜研究中发现其mtDNA的RAPD有很强的多态性，而cpDNA则没有多态性；许仁林等运用AP-PCR技术比较了野败型水稻珍汕97A、保持系珍汕97B以及F1的mtDNA多态性，结果从雄性不育系中得到一个特异的扩增片段；黄占景等利用RAPD技术对A型（普通小麦）、K型及T型不育系及保持系线粒体DNA进行了分析，发现在不育系及保持系mtDNA之间存在多态性差异；构建了T型不育系的保持系线粒体DNA的两个基因文库；通过花粉管通道法将重组质粒导入不育系，使部分植株的育性得到了不同程度的恢复；首次提出并研究发现了保持系mtDNA 中的育性恢复基因，并获得了育性转化株，为分离育性恢复基因，开展小麦雄性不育基因工程，创造工程恢复系奠定了基础。
3．3 RAPD及AP-PCR方法所获得的DNA的多态性数据涉及了植物mtDNA全基因组，范围广，差异片段多且复杂，能够反映出mtDNA中的很多差异，这些差异有的与CMS有关，有的与CMS无关，而无关的信息常常是大量的，致使CMS 相关信息可能被掩盖，当与遗传测交分析法的结果相比较时，有时可能存在偏差。因此有必要分离和克隆这些差异片段并作进一步的分析和鉴定。还有一个值得注意的问题是，在发现保持育系同雄性不育系线粒体DNA多态性的同时，许多研究也发现了在细胞质相同的各不育系之间线粒体DNA也存在差异。虽然各不育系之
间线粒体基因大小相似，但其中一些基因的拷贝数和核苷酸顺序却迥然不同。也就是说这种结构的差异可能来源于进化过程中线粒体DNA的重组或重排，并不能真正代表细胞质雄性不育的本质。现在许多作物都已发现了多种不同类型的细胞质雄性不育源，因此单单从比较不育系和保持系mtDNA差异来了解雄
性不育的机理同样是较困难的。
4  烟草线粒体DNA的研究进展。
4．1由于线粒体在细胞内的作用，有很多研究都以烟草为模式植物探求植物基因功能，并将一些核基因编码的蛋白定位于烟草的线粒体膜上，而对于烟草线粒体DNA的研究却还没有系统的进行研究。转基因技术和反义RNA技术在确定基因功能的研究中非常有效，由于很难直接将目的基因整合到线粒体基因组中，人们发现很多植物线粒体蛋白是由核基因编码，这些蛋白在细胞质中合成后再输入线粒体，众多核编码的线粒体蛋白均有一段引导序列，因此有研究人员将线粒体（突变）基因与引导序列融合后转化植物来研究线粒体基因的功能，Hernould 等将小麦atp9基因cDNA导入烟草并获得转化植株，在转化烟草植株育性观察中发现，含引导序列的atp9的转化烟草皆为可育，而无引导序列的atp9转化植株有的可育、有的半不育、有的完全雄性不育，因此atp9基因转录产物可能对细胞质雄性不育性的形成有很大的影响；Chaumont等将玉米ufr-13基因采用类似的方法转化烟草，但未能出现预期的结果。云南烟草科学研究院正在通过对三个不同的雄性不育系进行线粒体DNA特有序列多态分析，在RAPD、ALFP和差异表达等方面均有新的发现（肖炳光，待发表）。
4．2由于突变mtDNA重排与同源重组导致一些不正常的发育，为研究胞质雄性不育（CMS）的形成机理，人们不仅在Arabidopsis、矮牵牛、水稻、玉米和小麦等植物上进行线粒体基因转录和RNA编辑等方面的探索，也在烟草上进行了同样的研究；
虽然美国北卡大学的Bland等分离得到克隆了烟草线粒体atp9、atp6基因，但迄今为止对烟草线粒体基因的研究也屈指可数，Vanlerberghe（1994）克隆了AOX基因，Bohner等（1997）克隆了COB基因，Bergman等（2000）克隆了atp1基因，Chaw等（2000）克隆了核糖体RNA基因，Carrillo等（2001）克隆了Nad1基因，Picault等（2002）克隆了4个dtc基因，有关核糖体DNA等方面的数据
也往往用于系统进化比较分析研究，对线粒体中tRNA基因、rRNA基因、ATP酶基因、细胞素氧化酶基因和细胞素还原酶基因的研究欠系统、全面和深入，主要的限制因素是现在尚未有烟草的mtDNA完全序列，使得胞质雄性不育（CMS）形成机理等方面的研究未取得突破性的进展。
5  结束语。
目前，有关烟草及其它植物线粒体DNA方面的研究已经取得一些进展，由于植物细胞存在两种内共生的细胞器线粒体和质体（或叶绿体），使有关线粒体DNA方面的研究显得更为复杂，也因此对植物线粒体DNA的研究提出更高要求。在近些年的研究过程中，植物线粒体DNA的许多独特之处已经被发现。今后随着技术的发展以及植物（烟草）基因组计划的进行，植物（烟草）线粒体DNA的基因功能等方面的遗传研究将更加深入。
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