2016年12月
December2016Chinese Journal of Chromatography Vol.34 No.12 1145-1153
邹汉法研究员纪念专辑（上）•专论与综述DOI: 10.3724/SP.J. 1123.2016.09003糖蛋白质组学中基于化学反应的富集方法研究进展
包慧敏，谢力琦，陆豪杰$
(复旦大学化学系，生物医学研究院和老年医学研究中心上海200433)
摘要：蛋白质糖基化是一种广泛存在的重要的蛋白质翻译后修饰，糖基化肽在总酶解肽中占的比例不超过5%，这使得糖肽的分离富集成为糖蛋白质组学研究发展的关键技术之一。在诸多糖蛋白质组富集技术中，化学方法是富集技术的主导，本文从化学反应的角度介绍糖基化蛋白质富集的技术进展。富集过程按照连接和释放分别讨论，在连接过程中，重点介绍硼酸化学法、肼化学法、胺化学法和肟点击法；在释放过程中，以况-糖蛋白的酶释放法和0-糖蛋白的洚消除法为主导，一并介绍了最新的氧化断裂释放的化学法。最后，讨论总体富集策略的发展现状。
该文以糖蛋白富集的共价反应为核心，分析不同方法的优缺点以及各技术在糖蛋白质组学研究中的应用和贡献。
关键词：糖蛋白质组；蛋白质糖基化；糖蛋白；富集；连接/释放；共价反应；综述
中图分类号:〇658 文献标识码:A 文章编号：1000-8713( 2016) 12-1145-09
Research advances of enrichment approaches based on
chemical reactions in glycoproteomics
BAO Huimin，XIE Liqi，LU Haojie^
(D epartment o f C hem istry，Institutes o f Biomedical Sciences and Research Center on
Aging and M edicine，Fudan U niversity，Shanghai 200433，China)
Abstract：Protein glycosylation is one of the most common and important post-translational modifications (PTMs)in mammalian cells.Glycopeptides usually exist at relatively low abundance(less than5%)compared with non-glycosylated peptides.So，enrichment approaches are important for the analysis of glycoproteome.Approaches based on chemical reactions are the main trend，here we discuss them from chemical viewpoint.There are two main processes for enrichment of glycoproteins，glycoprotein conjugation and the release from solid phase.In conjugation process，we
introduce four types of chemical reactions：one is boronic acid chemistry based on reaction between boronic acid and cis-diol groups on free glycans，and the other three are covalent reactions between aldehyde groups and functionalized groups，hydrazide for hydra-zone ligation，alkylamine for reductive amination，aniline for nonreductive amination and ami-nooxy group for oxime click chemistry.In release process，^-glycosidase(PNGase)F for ^-glycosylated proteins，^-elimination reaction for0-glycosylated proteins and a bleach method published recently are introduced，and the oxidative releasing of natural glycans is also introduced here.In addition，analysis strategies for N-/0-glycoproteins are discussed，including detection in glycoproteins and site-specific glycan occupancies.This review mainly focuses on the currently available chemical approaches based on covalent reactions for enrichment of gly-coproteins，as well as new materials derivatized with different functional groups.We compare the advantages and disadvantages of different methods and try to evaluate the contribution and
收稿日期：2016-09-01
$ 通讯联系人.Tel:(021)54237618,E-mail :luhaojie@ fudan.edu.
基金项目：国家重点研发项目（2016YFA0501303 )；国家自然科学基金（ 20905014, 21335002)；上海市自然科学基金(14ZR1403600)；上海市老年医学临床重点实验室建设项目（13dz2260700).
Foundation item：National Key Research and Development Program (No. 2016YFA0501303) ；National Natural Science Foundation of China (Nos. 20905014，21335002)；Shanghai Natural Science Foundation ( No. 14ZR1403600)；
Shanghai Key Laboratory of Clinical Geriatric Medicine Construction Project (No. 13dz2260700).
• 1146 •谱第34卷
future trend based on authors viewpoint.
Key words：glycoproteome；protein glycosylation；glycoprotein；enrichment；conjugation/ release；covalent reaction；review
蛋白质糖基化在细胞间的识别、信息交流和传 递中发挥重要的生物学功能。糖基化蛋白质在病原 对宿主的感染、癌症的发生和转移等生物过程中起 重要的作用[|，2]。蛋白质糖基化的异常和肿瘤的发 生、发展密切相关，美国食品药品监督管理局(FDA)批准用在临床上的肿瘤标志物中有一半以 上是糖蛋白[3]。甲胎蛋白（AFP)就是一种被广泛 应用于肝癌早期临床诊断的血清糖蛋白，肝癌病人 甲胎蛋白糖链上的核心岩藻糖含量显著增加[4,5]。已有研究表明，以蛋白质的核心岩藻糖化水平作为 疾病诊断标志物比蛋白质水平更灵敏、更具特异 性[6]。此外，用于前列腺癌诊断的前列腺特异性抗 原（PSA)、用于胰
腺癌监测的癌抗原19-9(CA19- 9)、用于乳腺癌监测的癌抗原15-3(CA15-3)、癌抗 原CA27-29和CA-125等都是糖基化蛋白质[7]。
哺乳动物蛋白质中超过50%发生了糖基化，但 糖基化肽却仅占蛋白质酶解肽的2%〜5%[8]，加上 糖链的微观不均一性以及在检测过程中非糖肽对糖 肽质谱信号的抑制，这些都限制了糖蛋白检测的灵 敏度[9]。将糖肽从复杂体系中高选择性地分离富 集出来并达到质谱可以检测的水平是糖蛋白质组研 究首先要解决的一个基础问题。
目前已经发展了多种糖蛋白的富集方法，按照 作用原理可以分为通过非共价键连接的方法和通过 化学反应形成共价键连接的方法。通过非共价键连 接的方法包括亲和法（凝聚素法和免疫法）和亲水 法。凝集素本身的特性使凝聚素法不具备普适性, 且作用较弱[10,11]。免疫法利用抗原抗体结合的专 一性，主要是在含有〇-GlcNAc(0连接的，乙酰葡 糖胺）的糖蛋白或糖肽中应用，该方法缺乏通用性[12,13]。亲水法利用糖链多羟基的亲水性进行分 离富集，由于肽段亲水基团的干扰，不可避免地存在 非特异性吸附[14,15]。以上非共价连接方法的共同 特点是选择性不好或普适性不够；而共价连接法利 用糖基本身的活性基团（多羟基或氧化后的醛基）与固定相上的功能基团形成的共价键为作用力，结 合牢固，可承受强烈的洗涤条件，因而在富集过程中 有更高的选择性。
通过化学反应形成共价键进行富集的方法包括 硼酸化学法、肼化学法、胺化学法和肟点击法。其中 硼
酸化学法利用糖链的顺式邻二醇结构可形成环状二酯进行富集，有条件温和、反应可逆和不破坏糖链 结构的特点；其他3类方法均需要将糖肽通过高碘 酸钠预氧化产生醛基，利用醛基的反应活性进行富 集。由于共价连接法有高选择性的突出优点，加上 和新型材料的兼容性，有越来越多的商品化试剂涌 现，共价连接法富集是糖蛋白质组学研究中最活跃 的领域。共价连接法包括共价连接肽链和共价连接 糖链，共价连接糖链居多，是本文重点讨论的内容。
1共价反应连接法
糖蛋白富集包括两个关键过程：糖链的连接和 释放。糖链上特殊的邻位多羟基结构，是糖蛋白富 集中共价反应连接法的基础。在连接过程中，根据 糖链与外源功能基团的共价反应类型分为：硼酸化 学法、肼化学法、胺化学法和肟点击化学法。富集过 程中共价连接反应原理见图1。其中，硼酸化学法 普适性强，能特异性富集所有顺式邻二醇结构的糖。肼化学法、胺化学法和肟点击法这3种方法都需要 预氧化，将多羟基结构通过氧化反应转变为反应活 性更高的醛基，醛基可以与酰肼发生肼腙反应（肼 化学法），醛基可以与酰胺/苯胺发生胺化反应（胺 化学法），醛基还可以与羟胺生成肟（肟点击法）。所有的共价连接法在连接过程中对仏糖、0-糖等均 没有明显的歧视效应。
1.1硼酸化学法
硼酸化学法利用硼酸基与糖链上的顺式二羟基 的可逆结合进行富集，在碱性条件下，硼酸基与邻位 顺
式二醇发生酯化反应形成环状二酯；当溶液调至 酸性条件下时，反应逆向进行，环状二酯发生水解释 放出完整糖肽[16]。该二酯的解离常数大约在10_3〜10_4数量级，据硼酸衍生物和反应底物的不同而 异[17]。可逆反应结合常数低，伴随着相对低的选择 性，将硼酸固定修饰在低吸附的固相表面将有助于 该问题的解决。目前，有大量工作围绕硼酸功能化 新材料作为固相载体辅助糖蛋白的富集进行，均取 得不错的效果。
磁性纳米颗粒拥有大的磁效应系数，在溶液中 容易分离，是一种理想的糖肽分离富集基质。本课 题组[18]成功地合成了硼酸功能化的“核-卫星，’结构 的新材料，以Fe3〇4@ Si〇2为“核”，以硼酸功能化 的金纳米粒子Au@B(0H)2为“卫星”，中间以长
第12期包慧敏，等：糖蛋白质组学中基于化学反应的富集方法研究进展• 1147 •
a. oxidation of c^s-diol groups on glycans to aldehyde groups；b-f. covalent coupling glycoproteins to solid phase. Chemical conjugation methods include (b) boronic acid chemistry between c^s-diol groups and boronic acids，and covalent reactions between aldehyde groups and the other functionalized groups，such as (c) hydrazide，(d) reductive amination，（ e) nonreductive amination and (f) oxime click chemistry.
的有机链相连。金纳米颗粒增加固相表面积，长的 有机链减少了空间阻力，抑制了非特异性结合。将
这一硼酸修饰的材料用于结肠癌组织中糖肽的富 集，鉴定到155个糖蛋白，194个糖基化位点，其中 有165个糖基化位点为首次报道（占85. 1%)。由于合成材料表面不可能完全被硼酸基团覆盖，所以 材料表面非特异性吸附很难避免。进一步利用聚甲 基丙烯酸甲酯修饰的纳米颗粒竞争性地吸附非糖 肽，通过两种不同修饰表面的纳米颗粒的协同作用，极大地提高了糖蛋白的选择性，简化了洗涤的步骤，糖肽的回收率提高到90% [19]。同时，也有报道将硼 酸修饰到磁性碳纳米管[2°]、两性离子包被的核壳结 构的磁纳米颗粒[21]上。介孔纳米颗粒由于其具有 高比表面积、大的孔容、均匀的孔径分布等优势被用 于蛋白质/肽的吸附，发展了两步法合成硼酸功能化 的介孔硅材（FDU-12-GA)并用于糖肽富集。将糖 肽的检测限降低了两个数量级，大表面积和空间限 域效应加速了反应的发生，上样时间缩短到15 min[22]。更进一步，硼酸嫁接介孔材料MCM-41利用硼酸的选择性和材料体积排阻的特点在糖肽富集 中展现了优良的选择性（糖肽和非糖肽的物质的量 比为1:100)、高检测灵敏度(fmol)、大结合容量(40 mg/g)和高回收率（高达88. 10%)[23]。
树枝状材料有多位点和亲水的特点，Wang 等[24]将其功能化衍生，发现硼酸嫁接在树枝状材料 上显示了很多的优点，如：有很好的酸解离常数，可 达到10-5〜10-6mol/L，比单个硼酸键合高出3〜4 个数量级;HRP(horseradish peroxidase)的结合容 量可达(0.41±0.06) pmol/g，鉴定到9个糖基化位 点，检出限达到10-14mol/L；结合/解离过程快，结 合过程为1min，解离过程为5 min，而通常硼酸粒 子富集过程需1h；对寡糖耐受。为了兼容体内糖 蛋白存在的近中性环境，避免硼酸法在碱性条件下 富集引起的糖蛋
白降解。Zhang等[25]合成磁性核 壳微球Fe304@PAA-AOPB，壳上修饰功能化苯硼 基团，该基团的p^接近7，可以与顺式二醇形成五 元环酯，该硼酸功能化的微球展现了对糖蛋白的高 选择性的优点（HRP和牛血清白蛋白（BSA)
的质量
• 1148 •谱第34卷
比达1:80)。
刘震课题组[26]长期从事硼亲和材料用于分离 和分子识别的研究，他们总结出硼酸的亲和力与硼 酸键的之间的规律。通常硼酸键p^a低，硼酸 亲和过程需要相对低的pH条件，同时具有较高的 亲和力。另外，硼酸的亲和力与硼酸连接的配基结 构以及硼酸修饰的支持介质有关，它们共同决定了 亲和反应过程中与硼酸亲和作用力相竞争的二级作 用力（氢键、离子键、疏水作用）的强弱，最终反映在 硼酸的亲和能力上。他们总结了低p i的硼酸结 构类型，做了糖类物质的高效硼亲和固相标记[27]，并发展了新的硼酸亲和方法用于糖蛋白的测定[28,29]。他们的工作对功能化硼酸配基的结构给 出了一定的理论指导，对现有工作结果给出了很好 的解释。目前硼酸化方法能够在接近中性的条件下 实现与顺式二醇的反应，然而糖蛋白中有很多伯胺 基团的存在，因此该方法离实际糖蛋白的富集还有 很大的距离。
1.2肼化学法
肼化学法和硼酸化学法同样是利用糖蛋白糖环 上的邻二醇结构进行富集，不同的是肼化学法需要 先将糖链上邻二羟基的结构氧化成醛基，醛基与肼 基发生共价反应生成腙键，故又称肼腙法。肼化学 反应法中的功能基团是肼基，可以是苯肼或酰肼，通 过酰肼富集，糖蛋白的选择性可达90% [30]。
2003年，Zhang等[3|]使用此反应建立了界糖蛋白固相萃取（solid phase extraction of H inked glycopeptides，SPEG)法，将肼化学为基础的方法 用于，糖肽富集。肼化学法可以结合不同的固定 相，比如肼磁珠[32]、金纳米颗粒[33]、聚合物[34]、树枝 状聚合物[35]，已发展了一系列功能化材料用于糖蛋 白的选择性富集。本课题组[34]设计并合成了肼基 功能化的磁纳米材料（Fe304@PMAH)，通过聚合 物包被磁纳米颗粒，表面羧基与己二酸二酰肼形成 肼功能化的磁球。丰富的肼基团可以高效并特异地 富集糖肽，磁核便于溶液中的分离，亲水的聚合物表 面能够减少非特异性吸附。为满足低丰度痕量糖蛋 白的检测，需要发展更加灵敏、快速的富集新方法。本课题组[35]设计合成了肼功能化的树枝状材料，结 合过滤辅助（FASP)技术用于高灵敏和高选择性富 集，糖肽的研究。树枝状聚合物（PAMAM)可以溶 解于水相，并且表面拥有丰富的反应基团，因此在保 证满足低丰度糖肽高效富集的同时，均相溶液反应 保证了富集的重复性。将该方法应用于人血清样品 中糖肽的分析，成功检测到158条糖肽，鉴定到60个不同的糖蛋白。
肼化学法和肽W糖酰胺酶F(PNGase F)结合 富集，糖蛋白在糖蛋白质组学中的应用最为广泛[36,37]，也可以结合其他酶选择性地释放特定的糖 肽。肼化学法也可通过改变氧化反应的条件，选择 性氧化唾液酸的侧链[38]、甘露糖片段的顺式邻二 醇、葡萄糖片段的反式邻二醇、〇-GlcNAc蛋白质的 乙酰葡糖氨基[39]，实现对特定结构糖肽/糖蛋白的 富集。肼化学反应法有反应专一性高、无位点偏向 性、共价腙键稳定的优点；但肼化学法富集属于多步 骤反应，条件不易控制，且操作较复杂，还有耗时较 长的缺点。
1.3胺化学法
胺化学法反应的功能基团是氨基，糖链上经过 氧化后的醛基与固相载体上的氨基反应。胺化反应 的关键步骤是羰基和氨基在酸性条件下生成Schiff 碱，因Schiff碱的稳定性较差，通常是通过NaBH4还原为稳定的C-N单键最终形成稳定的仲胺，称为 还原胺化法[40]；或通过与能产生共轭的氨化物反 应，比如苯胺，可以增强产物的稳定性，称为非还原 胺化法。
和肼化学法相比，还原胺化减少了质谱分析前 脱盐的步骤，可以简化操作。本课题组[41]设计并通 过一步法合成了氨基功能化的磁性纳米颗粒，用于 V-糖基化肽的富集，缩短提取时间到4 h，糖肽的检 测灵敏度提高了 2个数量级。在5 的人血清中
鉴定到111个，糖基化位点和108条糖基化肽，并 成功将核酸酶B从牛血清中富集出来。在实际样 品中，胺化反应可能会存在肽上伯胺与醛基的副反 应，使非糖肽竞争性地抑制氨基磁珠对糖肽的富集。根据胺化机理，胺化反应要先形成Schiff碱为中间 态，而在还原之前形成Schiff碱的过程是可逆的，大 量存在的非糖肽会竞争性地和氧化后的醛基结合。邹汉法课题组[42]通过预先对肽链进行二甲基化封 闭再用胺化学法富集糖肽，大幅度地提高了糖肽富 集的效果，V-糖基化位点鉴定数量提高了 110% (从 126个到264个），对于N端是Ser/Thr的界糖肽，则从2个增加到25个。
胺化反应中间体Schiff碱不稳定，不同于脂肪 胺的是芳香胺与醛基反应产生的Schiff碱由于形成 大的共
轭体系可以增加其稳定性，不需要将C=N 双键还原为C-N单键，而且共轭的Schiff碱在宽的 pH范围内稳定[43]，可以进一步简化操作。用苯胺 代替脂肪胺与寡糖链的还原端生成稳定的胺化产 物，该方法已经成功地用于糖链衍生的质谱鉴定
第12期包慧敏，等：糖蛋白质组学中基于化学反应的富集方法研究进展• 1149 •
中[44]。本课题组[45]设计并合成了苯胺功能化的磁 纳米材料，将非还原胺化反应引人糖肽的富集中，发 展了新的糖蛋白分离富集方法。
胺化学法与肼化学法类似，无偏向性，通过探索 适合的含有共轭基团的试剂、发展非还原胺化，减少 反应步骤，简化操作。胺化学法是近几年新发展的 糖蛋白分离富集方法，利用胺化学法对糖蛋白大规 模普适性分离富集的应用还有待进一步发展。
1.4肟点击化学法
肟化反应是含有羰基的化合物（醛、酮类）与羟 胺作用生成含有肟基C=NOH的反应。该反应是典 型的亲核加成反应，经过加成消除历程。和酰肼比 较，羟胺由于a-效应具有更强的亲核能力[46]。加上 条件温和、产物稳定的优势，肟点击化学被用于很多 领域，在糖组学上已经用于糖还原端标记的糖印迹[47]。受糖印迹的启发，肟点击化学法被用于唾液 酸化糖肽的富集[48]。
Zeng等[49]利用唾液酸侧链的多羟基容易被氧 化的特征，发展肟点击的方法标记唾液酸化蛋白质，并用于活细胞表面唾液酸化蛋白质的标记和示踪。步骤为：高碘酸钠温和氧化唾液酸产生醛基，苯胺催 化与带有生物素标签的羟胺生成稳定肟键，最后，链 酶亲核素富集细胞表面唾液酸化的糖蛋白。苯胺催 化可以加速肟键生成，只需要低浓度的羟胺-生物素 试剂，在中性条件下就可以标记细胞表面绝大部分 唾液酸化的糖蛋白，同时不改变细胞活性。最近，发 展了羟胺功能化的生物素作为连接分子，针对含有 特定糖链（比如末端是唾液酸或半乳糖）的糖蛋白，通过肟化学法连接上生物素，最后通过商品化的链 酶亲核素树脂分离富集，糖蛋白富集获得高的特异 性[5〇]。
以上工作集中在标记示踪，本课题组[51]将肟点 击与新材料结合，发展了用于^-糖肽富集的方法。首先设计并合成了羟胺功能化的磁性纳米颗粒，然 后将氧化后的糖链通过肟化学连接。该方法富集过 程在1h以内，灵敏度提高到fmol水平，体现了良 好的选择性(糖肽和非糖肽的物质的量比为1:100) 和重复性（变异系数CVs<20%)，同时运用该方法成 功将人类大肠癌患者血清中的^-糖基化蛋白质分 离出来。
综上所述，硼酸化学法反应可逆、温和，适合对 完整糖蛋白的分析，但选择性不高。醛基为基础的 肼化学法、胺化学法和肟化学法虽然有预氧化步骤，增加了实验时间和操作的复杂度，但通过氧化产生 的高活性醛基大大提高了糖肽富集的选择性和特异性。结合不同特点的新材料，发展新的方法，可以满 足不同类型样品的研究需要。
2糖蛋白释放方法
蛋白质主要的糖基化类型有两种：一种是W-糖 基化，糖基片段通过氮原子链接在天冬酰胺的侧链 上，PNGase F酶可以特异地切割天冬酰胺和糖链 之间的连接；另一种为0-糖基化，糖基片段通过氧 原子链接在丝氨酸或苏氨酸的侧链上，0-糖基化蛋 白质在碱性条件下易发生^消除反应。对于这两 类糖基化蛋白质，富集后的释放原理见图2。
proteins after glycoproteins enrichment
a. ^-glycosidase F (PNGase F) for ^-glycoproteins，
b. f5-elimination to 0-glycoproteins. GlcNAc：^-acetylglucosamine.
2.1廖糖蛋白的PNGase酶切法
reaction研究酶切的方法可以用来分离糖链和肽链，常用的 是PNGase和糖苷酶（glycosidase)两类酶，糖苷酶 包括糖苷内切酶（endoglycosidase，Endo)和糖苷 外切酶(exoglycosidase，Exo)。
PNGase F是目前普遍使用的鉴定W-糖基化位 点的酶，在糖基化的研究中应用广泛。杨艽原课题 组[52,53]将PNGase F酶结合同位素标记用于糖基化 位点的定量研究。利用Endo不同亚型对糖型的专 一性可以鉴定糖基化位点以及糖链结构信息。将 Endo H与PNGAse F酶结合使用，从大鼠肝脏组 织中鉴定到1 063个高甘露糖型和杂合型W-糖基化 位点及相应的560个W-糖蛋白，其中大部分位点为 首次发现
[54]。钱小红课题组[55,56]采用可特异性酶 切复杂型核心岩藻糖结构的Endo F3酶从人血浆 样品中发现了超过100个含核心岩藻糖的糖基化位 点，并发展了相应的MRM定量技术。对于过于复 杂的糖链，将多种糖苷外切酶组合，即可分析糖链的 组成、序列、连接和构象。促红细胞生成素和人血浆 铜蓝蛋白的W-
糖链结构得到精细解析就是成功的
版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。
发表评论