2018年第37卷第12期          CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS    ·4821·
化    工    进
展
α-酮异己酸的生物合成研究进展
程申，张颂红，贠军贤
（浙江工业大学化学工程学院，绿化学合成技术国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 310032）
摘要：α-酮异己酸是重要有机酸、药用氨基酸合成前体、新陈代谢调节因子和药物，其生物合成路径条件温和，环境友好。本文对α-酮异己酸的生理功能和体内代谢机理进行了归纳，并着重对其生物合成路径的研究进展进行了综述。现有研究表明，α-酮异己酸可用葡萄糖为底物，通过代谢工程改造的谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌工程菌发酵合成，但产物浓度较低；或以L-亮氨酸为底物，经氨基酸转氨酶、氧化酶、脱氨酶、重组工程菌或全细胞催化转化合成，产物浓度较高。α-酮异己酸高产菌株的筛选、利用代谢工程方法对菌株进行改造以构建高效工程菌、发酵与分离提取工艺优化等问题，是今后需要研究的重点。
关键词：α-酮异己酸；生物合成；代谢工程
中图分类号：Q939.97      文献标志码：A      文章编号：1000-6613（2018）12–4821–09
DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613. 2018-0193
Recent advances in microbial synthesis of α-ketoisocaproate
CHENG Shen, ZHANG Songhong,YUN Junxian
（State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering,
Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, Zhejiang, China ）
Abstract ：α-Ketoisocaproate (KIC) is not only an important organic acid and key precursor of branched chain amino acids for pharmaceuticals, but also a metabolic regulator and therapeutic agent. Biosynthesis pathway for the production of KIC has advantages of the mild reaction conditions and environment-friendly processes. In this work, the advances of the important physiological properties, the metabolisms and the biosynthetic pathways of KIC, were summarized. According to the references, two biosynthetic pathways are available for the preparation of KIC. The first one is the microbial fermentation approach using the strains of Corynebacterium glutamicum  by metabolic engineering or recombinant Escherichia coli  with glucose as the substrate, where the yield is low. The another is the enzymatic catalyzing using amino acid aminotransferases, oxidases or deaminases, the whole-cell bioconversion and the recombinant engineering strains using L-leucine as the substrate, where the yield is slightly high. Issues regarding the metabolic engineering improvement of the yield of KIC, the biosynthesis pathway, and the advanced fermentation and separation techniques, were proposed and considered as the important future research directions.
Key words: α-ketoisocaproate ；biosynthesis ；metabolic engineering
α-酮异己酸（α-ketoisocaproate ，KIC ）即4-甲    基-2-氧代异己酸，是一种重要的高值有机酸和药物，在生物体内可与L-亮氨酸相互转化，如图1
所示。α-酮异己酸作为L-亮氨酸的直接代谢物，可与L-亮氨酸协同调节机体新陈代谢，维持体内氧化 收稿日期：2018-01-22；修改稿日期：2018-03-17。 基金项目：国家自然科学基金（21576240）及浙江省自然科学基金
（LZ14B060001、LY16B060011）项目。 第一作者：程申（1992—），男，硕士研究生。联系人：贠军贤，教授，博士生导师，主要研究方向为生物分离与转化、生物修复、微化工及药
物载体内的传递现象。E-mail yunjx@zjut.edu 。
化    工    进    展                            2018年第37卷
·4822
· 图1  α-酮异己酸和L-亮氨酸相互转化 还原环境[1-2]。此外，α-酮异己酸也是有机合成和生
物合成中的重要中间体，在生物、医药、化工、化
妆品、食品、饲料等诸多领域具有重要的应用      前景[3]。
α-酮异己酸可通过化学法合成，主要有羰基化
法、格氏试剂法、酰基水解法和海因法等。
但其反应条件苛刻，而且需要特殊结构的起始物，
常需要使用钴、钯、镧等稀有贵金属或毒性较大的
，产率不高，很难实现大规模生产[4]。用生
物法合成α-酮异己酸条件温和，工艺路线简单，有
利于工业化生产，成为近几年国内外重点关注的研
究方向[2,5]。本文对α-酮异己酸的生理作用、代谢机
理、化学合成法和微生物合成法等方面的研究进展
进行综述。
1  α-酮异己酸的生理作用 1.1  促进骨骼肌的合成
与L-亮氨酸类似，α-酮异己酸通过抑制肌肉蛋
白水解而具有抗分解代谢的特性，尤其能促进骨骼
肌中蛋白质的合成[6-7]。ESCOBAR 等[8]研究了L-亮
氨酸、α-酮异己酸和L-正亮氨酸对仔猪蛋白质合成
的影响，结果表明，注射L-亮氨酸和α-酮异己酸能
特异性诱导骨骼肌中蛋白质的合成，使仔猪骨骼肌
中的蛋白质合成比对照组更快，而注射L-正亮氨酸
不影响肌肉蛋白质的合成。FLAKOLL 等[9]研究了α-
酮异己酸对羊肉生长的影响，结果表明，对生长的
羔羊补充α-酮异己酸，可以增加体重和促进肌肉生
长，同时可以减少脂肪沉积。
1.2  调节体内氮平衡
α-酮异戊酸和α-酮异己酸等作为必需氨基酸酮
类似物或酮类药物，通过转氨作用，在体内自由地
转化为必需氨基酸，可以降低慢性肾病患者血浆中
的尿素浓度；同时，其含氮量少于必需氨基酸，可
以减少肾脏的氮负荷，缓解尿毒症症状，减缓肾功
能的下降。因此，α-酮异己酸可用于慢性肾脏病患
者的输液，作为其相应支链氨基酸的无氮替
代品[5,10]。
α-酮异己酸盐作为酮类药物还可以调节体内氮
平衡[11]，为低蛋白饮食的慢性肾病患者补充此类药物，肾小球过滤率下降幅度明显减少，但对患
者血清白蛋白和蛋白质浓度无影响，表明低蛋白饮
食并且补充此类药物可以缓解肾衰竭，而且不会导致营养不良。另外，慢性肾病患者孕妇低蛋白饮食会影响胎儿的生长，但对其同时补充此类药物的试
验表明，孕妇的营养状态良好[12]。 1.3  调节体内血糖平衡 LECLERCQ-MEYER 等[13]通过体外大鼠试验，
研究了α-酮异己酸盐对胰腺代谢的影响。结果表明，10mmol/L 的α-酮异己酸盐能明显抑制胰高血糖素的释放；在低浓度葡萄糖（3.3mmol/L ）条件下，α-酮异己酸还明显抑制了胰岛素的释放，其抑制作用与葡萄糖的抑制作用相似，两者在调节胰高血糖素释放中起重要作用。 α-酮异己酸和α-酮基己酸盐、α-酮戊酸盐和β-苯基丙酮酸盐等其他α-酮酸阴离子共同作用，可以刺激胰岛分泌胰岛素。α-酮异己酸可直接抑制胰腺β-细胞中三磷酸腺苷（ATP ）敏感的K +通道（KATP 通道），影响胰岛素分泌。在直接抑制KATP 通道的同时，转氨作用生成的α-酮戊二酸还能通过激活柠檬酸循环和线粒体产生ATP ，间接抑制
KATP 通
道。当直接和间接KATP 通道抑制足够强时，会刺激胰岛素释放。另外，线粒体产生的α-酮戊二酸和ATP 也促进了胰岛素分泌。现有研究结果表明，α-酮异己酸刺激胰岛素的释放可能是由于直接抑制和间接抑制共同作用的结果[14-15]。 2  α-酮异己酸的生理代谢 α-酮异己酸在机体内通过转氨酶的作用，实现与L-亮氨酸的相互转化，共同调节机体新陈代    谢[7,16]。整个代谢过程如图2所示。L-亮氨酸将氨基转移到α-酮戊二酸上，生成谷氨酸和α-酮异己酸；谷氨酸在大多数情况下被代谢成为谷氨酰胺。这种转化大部分发生在骨骼肌中，其中L-亮氨酸的代谢与谷氨酰胺循环密切相关[17]。 α-酮异己酸代谢途径有两条[7,18]，其中一条发生在肝脏线粒体中，如图2中左边虚框部分所示。由于线粒体中催化α-酮异己酸的酶活性高于细胞质中，大部分α-酮异己酸通过支链α-酮酸脱氢酶不可逆地氧化为异戊酰-辅酶A 。异戊酰-辅酶A 在线粒体内经脱氢酶合成β-甲基-巴豆酰-辅酶A （MC-CoA ），经羧化酶进一步分解代谢，产生β-甲基-葡萄苷-辅酶A （MC-CoA ），生成的β-羟甲基戊二酸单酰-辅酶A （HMC-CoA ）经裂解酶作用，
第12期程申等：α-酮异己酸的生物合成研究进展·4823·
最终在线粒体内生成乙酰乙酸和乙酰-辅酶A。乙酰乙酸是L-亮氨酸代谢的主要产物，在遗传错误或生物素缺陷时，给猪饲喂异戊酰-辅酶A会导致MC-CoA浓度增加，并随后转化为β-羟基-β-丁酸甲酯（HMB）[17]。
α-酮异己酸的另一条代谢路径发生在细胞质中，通过α-酮异己酸双加氧酶合成HMB。文献中常用L-亮氨酸向HMB的转化来表示该过程的转化率，约5%的L-亮氨酸最终代谢成HMB[19]。以肝脏匀浆体外试验研究以及猪和绵羊体内试验的结果表明，L-亮氨酸对HMB的内源转化率为2%～10%[20-21]。HMB可以经β-羟基-β-丁酸甲酯-辅酶A （HMB-CoA）代谢直接转化为HMG-CoA，也可以经脱氢转化为MC-CoA，再羧化为MG-CoA，最终代谢为HMG-CoA。HMG-CoA在HMG-CoA还原酶的作用下，生成甲羟戊酸，这是胆固醇合成的重要步骤[17]。HMG-CoA也可以在HMG-CoA合成酶的作用下合成乙酰乙酰-辅酶A。HMB很容易代谢作为胆固醇合成的关键碳源[7,21]。HMB的另一条路径是随尿液排出体外，如在猪和绵羊体内，约三分之一的HMB以这种方式排出；而人体补充HMB，高达一半通过尿液排出[17]。reaction研究
3  α-酮异己酸的生物合成与调控
α-酮异己酸作为支链α-酮酸和双羰基化合物，容易发生脱羰基、脱羧基和氧化等反应，稳定性较差，在空气中易氧化，而α-酮酸盐在空气中比较稳定，易于保存，因此常将α-酮异己酸转变成α-酮异己酸钠盐或α-酮异己酸钙盐保存。虽然α-酮异己酸的化学合成法较多，但并不系统，尚有较大的局限性，制备合成路线复杂、条件苛刻、产品收率低、废物多，环境污染问题比较突出[22]。
相对化学合成法，微生物转化合成α-酮酸具有成本低、反应条件温和、环境友好等优点，引起越来越多研究者的关注[23]。以葡萄糖或L-亮氨酸为底物催化转化合成α-酮异己酸。但是，α-酮异己酸在微生物体内代谢过程中不稳定，发酵过程中伴随副产物的形成，从复杂发酵液中快速高效分离α-
酮异图2  α-酮异己酸的合成与代谢途径[7]
化工进展                            2018年第37卷·4824·
己酸难度大，且转化反应受温度、pH、菌浓度等因素的影响。目前，发酵和转化合成α-酮异己酸的菌株较少，通过发酵转化得到的α-酮异己酸浓度低，所以，高产菌株的筛选尤为重要。
3.1  催化转化葡萄糖合成α-酮异己酸
对谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌进行基因工程和代谢工程改造，构建α-酮异己酸的高产工程菌株，是最近微生物合成α-酮异己酸的重点发展方向。谷氨酸棒状杆菌合成L-亮氨酸的代谢途径如图3所示[24-27]。其中，α-酮异己酸是该过程中的重要中间产物。对谷氨酸棒杆菌进行代谢工程改造，以葡萄糖为原料可以增加酮酸合成途径的通量，敲除α-酮异己酸代谢过程中支流代谢路径的关键基因，阻断酮酸向氨基酸转化的酶，可以提高α-酮异己酸的产量。葡萄糖经过糖酵解途径生成重要前体丙酮酸，再通过3步反应合成α-酮异戊酸，丙酮酸经ilvBN 基因编码的乙酰羟酸合成酶（AHAS）将两分子的丙酮酸缩合成α-乙酰乳酸，然后在ilvC基因编码的乙酰羟酸还原异构酶（AHAIR）催化下转化为α,β-二羟基异戊酸，再由ilvD基因编码的二羟酸脱水酶（DHAD）将α,β-二羟基异戊酸脱水形成α-酮异戊酸[24-27]。
α-酮异戊酸有3条代谢路径：第1条是通过ilvE 基因编码的转氨酶B（TAB）转化成L-缬氨酸；第2条是由panB基因编码的酮泛解酸羟甲基转移酶（KPHMT）催化起始，经3步反应生成D-泛酸[24-25]；第3条路径经3步反应生成α-酮异己酸，先后涉及到由leuA基因编码表达的α-异丙基苹果酸合酶（IPMS）、由leuCD基因编码表达的β-异丙基苹果酸脱水酶（IPMD）和由leuB基因编码表达的β-异丙基苹果酸脱氢酶（IPMDH）[27]。IPMS是α-酮异己酸生物合成中的限速酶，其催化α-酮异戊酸接受乙酰-辅酶A的乙酰基合成α-异丙基苹果酸，经IPMD催化合成β-异丙基苹果酸，其在IPMDH催化作用下进一步合成α-酮异己酸。研究表明，谷氨酸棒杆菌合成α-酮异己酸的过程，常常存在明显的底物、中间产物和产物抑制。产物L-亮氨酸浓度达0.4mmol/L时，就会对IPMS产生强烈的反馈抑制和阻遏，从而抑制了L-亮氨酸的合成[
28]。在高浓度L-亮氨酸条件下，转录抑制因子LtbR能够抑制leuCD和leuB的表达；而敲除谷氨酸棒杆菌的ltbR 基因，可以促进leuCD和leuB的表达，从而有利于α-酮异戊酸的微生物合成[29]。
对产L-亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌[27]ilvE基因进行敲除后，α-酮异己酸成为主要产物，但菌株为L-异亮氨酸营养缺陷型。VOGT等[2]以GTG替换ilvE 基因的ATG起始密码子，避免了营养缺陷，所得菌株能够在无氨基酸补充的葡萄糖培养基中生长，但是生长速率和α-酮异己酸合成下降。除了ilvE起始密码子替换，进一步敲除ltbR和iolR基因，
以增加图3  谷氨酸棒状杆菌生物合成L-亮氨酸途径示意图
第12期程申等：α-酮异己酸的生物合成研究进展·4825·
葡萄糖摄取，能够促进leuB和leuCD基因的表达[27]，改造后的谷氨酸棒杆菌MV-KICF1在1mmol/L异亮氨酸存在下，能够将1mol葡萄糖合成0.20mol α-酮异己酸，产物终浓度达47mmol/L （6.1g/L）。
BÜCKLE-V ALLANT等[5]敲除了谷氨酸棒杆菌中ltbR和ilvE基因，前者编码转录抑制因子LtbR，后者编码转氨酶B。过表达编码乙酰羟酸合酶、乙酰羟酸异构还原酶和二羟酸脱水酶的ilvBN、ilvC和ilvD基因，得到重组谷氨酸棒杆菌VB （pJC4ilvBNCD）。在L-亮氨酸限制下的摇瓶中发酵，每克葡萄糖可转化生成α-酮异己酸约0.19g，终浓度达31mmol/L，还同时生成了约33mmol/L的α-酮异戊酸。过表达异丙基苹果酸合酶等位基因（leuA EC-G462D）可以进一步提高α-酮异己酸产量。通过添加乙酸盐作为辅助底物，重组谷氨酸棒杆菌VB（pJC4ilvBNCD leuA EC-G462D）生成了9.2g/L α-酮异己酸，几乎不含α-酮异戊酸副产物（＜2mmol/L）。
3.2  催化转化L-亮氨酸合成α-酮异己酸
以L-亮氨酸为底物，通过纯酶、粗酶液或全细胞催化，可转化得到α-酮异己酸。该方法具有高效、无毒、无污染等特点。目前，催化L-亮氨酸生成α-酮异己酸的酶主要有3类，即转氨酶、氧化酶和脱氨酶，其催化机理及副产物均存在一定差异。
3.2.1  氨基酸转氨酶催化
转氨酶可以将氨基酸上的氨基转移给α-酮酸，形成新的α-酮酸和氨基酸，以磷酸吡哆醛为辅酶，反应是可逆的[17,30]。FREIDING等[31]从野生型沙克乳杆菌TMW1.1322获得无细胞提取物，对支链氨基酸L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸的转氨活性非常弱。在沙克乳酸杆菌质粒上表达副干酪乳杆菌中氨基酸
转氨酶基因，重组得到的沙克乳杆菌株，可以催化L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸生成相应的α-酮酸，且转氨酶活性比野生型菌株高25倍。
LIU等[32]利用蜡状芽孢杆菌中支链氨基酸转氨酶，将L-亮氨酸和丙酮酸转化为α-酮异己酸。用人工神经网络算法模拟和优化，底物L-亮氨酸浓度为15g/L条件下，转化得到α-酮异己酸浓度达5.63g/L。
转氨酶越来越多地应用于合成非天然氨基酸，表现出较宽的底物特异性，反应速率快且无需外部辅因子再生。使用这种方法可以有效地制备宽范围的D,L-氨基酸，在生物转化和天然氨基酸及手性胺的合成等方面具有重要意义[33]。3.2.2  氨基酸氧化酶催化
氨基酸可在氧化酶的作用下氧化生成α-酮酸和氨，其过程如图4所示。氨基酸被氧化为亚氨基酸，伴随着辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的还原，吸收分子氧再氧化FAD并产生过氧化氢，亚氨基酸经水解得到α-酮酸和氨 [34-35]。GEUEKE等[36]利用不透明红球菌DSM43250氨基酸氧化酶生产α-酮酸，该酶具有较宽的底物特异性。通过细菌破胞，对酶进行纯化，测定了其生物学性质，确定了氧化酶完整核苷酸序列，并推导出氧化酶的一级结构。以44种天然和非天然氨基酸和9种氨基酸衍生物作为氧化酶的底物，其中39种L-氨基酸被该酶氧化，L-亮氨酸相对于丙氨酸的相对活性达68%，显示出了不透明红球菌DSM43250氨基酸氧化酶的高立体选择性。该氧化酶能氧化碱性、芳香族和脂肪族L-氨基酸，但是α-氨基或α-羧基的衍生物不能被氧化酶氧化，D-氨基酸和L-叔亮氨酸也不能被氧化。L-正亮氨酸和L-亮氨
酸的K m和V max值比L-异亮氨酸高，主要是由于L-正亮氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-叔亮氨酸的空间结构不同，碳链位置上的支链导致活性依次降低，所以L-氨基酸碳链上的基团影响氧化酶的催化。
图4  氨基酸氧化酶催化反应示意图
SUN等[37]从白眉蝮蛇毒液中分离氨基酸氧化酶，该酶与L-亮氨酸反应，最适pH为4.7。金属离子可以提高该氧化酶对L-亮氨酸的水解速率，Tb3+对氨基酸氧化酶的影响最明显，使水解速度加倍；Mg2+使水解速率提高了50%。YANG等[38]从海兔肾的防御性紫油墨分泌物中分离出L-氨基酸氧化酶，该酶对L-赖氨酸、L-精氨酸催化活性最高，对L-酪氨酸、L-组氨酸和L-亮氨酸催化活性低。
STUMPF等[34]研究了变形杆菌中的氨基酸氧化酶，它能催化11种氨基酸氧化成相应的α-酮酸，释放出
氨。测试了全细胞和无细胞提取物中氨基酸氧化酶的活性，全细胞催化条件下L-亮氨酸相对于L-苯丙氨酸的相对速率为93%，无细胞提取物催化条件下L-亮氨酸相对于L-苯丙氨酸的相对速率为91%。

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。