Vol.41No.5May 2021
上海交通大学学报（医学版）
JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE)
人源MDN1蛋白质的电镜结构研究
许云涛，李明月，雷
鸣
上海交通大学医学院附属第九人民医院上海精准医学研究院，上海200125
［摘要］目的·利用负染电镜技术分析人源midasin AAA-ATPase 1（MDN1，又称Rea1）蛋白质结构。方法·利用CRISPR/Cas9基因编
辑方法在Expi293F 细胞内源MDN1蛋白质的氨基端敲入3×FLAG 纯化标签，采用ANTI-FLAG ®M2Agarose Affinity Gel 亲和层析和甘油密度梯度离心的方法分离纯化目的蛋白质；通过负染电镜技术和单颗粒（single-particle ）重构技术探究人源MDN1蛋白质结构。
结果·利用亲和层析及密度梯度离心方法分离纯化获得高纯度、均一性较好的人源MDN1蛋白质样品；采用甲酸铀负染后利用120kV
电镜初步解析了目的蛋白质MDN1的空间结构。结论·利用单颗粒重构技术搭建了人源MDN1蛋白质的低分辨率的负染模型。
［关键词］MDN1蛋白质；pre-60S 核糖体；核糖体成熟；负染电镜［DOI ］10.3969/j.issn.1674-8115.2021.05.001
［中图分类号］Q518.2
［文献标志码］A
Electron microscopic study of the human MDN 1protein
XU Yun -tao,LI Ming -yue,LEI Ming
Shanghai Institute of Precision Medicine,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200125,China
[Abstract ]Objective ·To study the structure of the human midasin AAA-ATPase 1(MDN1,Rea1)protein by negative-staining electron microscopy.
Methods ·Using the CRISPR/Cas9genome editing method,a 3×FLAG affinity tag was inserted into the N-terminus of MDN1in Expi293F cells.Tagged proteins were isolated via affinity purification with ANTI-FLAG ®M2Agarose Affinity Gel,followed by glycerol density gradient centrifugation.The purified protein sample was then subjected to negative-staining electron microscopy and single particle image analysis.Results ·The FLAG-tagged endogenous MDN1proteins with high purity and good homogeneity were obtained using affinity chromatography and density gradient centrifugation.Preliminary study on the structure of human MDN1was achieved by 120kV electron microscope after negative staining with uranium formate.Conclusion ·A low resolution model of human MDN1protein was achieved by single particle reconstruction analysis.[Key words ]MDN1protein;pre-60S ribosome;ribosome maturation;negative-staining electron microscopy
核糖体是人体内负责蛋白质合成的重要细胞器，影响着机体生长和繁殖等一系列活动。核糖体的组装和成熟是一个高度复杂的过程，受到很多组装因子的精密调控［1-3］，该过程的异常会导致心血管、神经、骨骼、造血系统等方面的疾病，如骨髓增生异常综合征（Shwachman-Diamond syndrome ，SDS ）、先天性角化不良（dyskeratosis congenita ，DC ）等［4-6］。在众多参与调控核糖体组装的蛋白
质因子中，AAA-ATPase （ATPase associated with
various activities ）［7］
家族是受到广泛关注的一类蛋白质，
该家族成员在不同阶段参与释放或者回收不同的pre-60S 核糖体组装因子，推动核糖体的成熟过程。AAA-ATPase 家族成员具有2个基本的特征：其一是氨基酸序列中含有1个或多个保守的AAA 结构域，AAA 结构域具有ATP 水解酶活性，通过水解ATP 获得能量来发挥其生理功能［8］；
其二是大多数AAA-ATPase 能够形成寡聚体，互相结合，协同作用，最常见的是形成doughnut-shaped 的六聚体环状结构，这是其发挥生理功能的结构基础［9-11］。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）中，有3种AAA-ATPase 参与pre-60S 核糖体成熟过程，分别为Ribosome biogenesis ATPase Rix7（Rix7）、Developmentally-regulated GTP-binding protein 1（Drg1）和Rea1［1］。Rix7是第1个与pre-60S 核糖体相互作用的AAA-ATPase ，主要与组装因子NOP seven-associated protein 1（Nsa1）释放有关［12-13］；Drg1主要在胞质中发挥作用，促进组装因子回收［14-15］；而Rea1促进Pescadillo homolog （NOP7）pre-60S complex 和Pre-rRNA-processing protein （Rix1）pre-60S complex 中的组装因子释放，是pre-60S 核糖体在核仁以及核质成熟中的关键因子［16］。
[基金项目]国家自然科学基金（31525007）。[作者简介]许云涛（1995—），男，硕士生；：********************* 。[通信作者]雷鸣，：************** 。
[Funding Information ]National Natural Science Foundation of China (31525007).[Corresponding Author ]LEI Ming,E-mail:**************.
[网络首发]knski/kcms/detail/31.2045.R.20210429.1322.002.html （2021-04-2916:11:07）。
创新团队成果专栏
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在上述3种AAA-ATPase中，Rea1作为在核内调控pre-60S核糖体组装因子释放的重要蛋白质，其敲低、敲除可致酵母死亡，在其他真核生物中对发育也有非常大的影响［17-21］。实验表明，Rea1的metal ion-dependent adhesion site（MIDAS）结构域与pre-60S核糖体组装因子Ribosome biogenesis protein Ytm1-Erb1-Nop7（Ytm1-Erb1-Nop7）的MIDAS-interacting domain（MIDO）结构域相互作用，Rea1将Ytm1从pre-60S核糖体上释放出来［16，22］；此外还发现Rea1在Rix1pre-60S核糖体中丰度很高，
并且通过其ATPase环状结构域与Rix1pre-60S核糖体相互作用［18，22-23］。最近发表的酵母源（Schizosaccharomyces pombe）的结构信息显示，该蛋白质由6个AAA结构域、连接肽（linker）、天冬氨酸/谷氨酸（D/E）以及MIDAS 结构域组成［24-25］；通过AMPPNP和ATP-ribozinoindole1（ATP-Rbin1）2种不同状态的对比发现，MIDAS结构域可能通过插入AAA环与pre-60S核糖体的组分相互作用，从而介导多种组分从pre-60S核糖体释放［26］。
Rea1在人源的同源蛋白质为midasin AAA-ATPase1（MDN1），是体内相对分子质量最大的蛋白质之一，全长包含5596个氨基酸残基，相对分子质量为632000。MDN1在pre-60S核糖体成熟中发挥着非常重要的作用，但是其相关结构生物学研究进展缓慢，这很大程度上限制了我们对pre-60S核糖体在核内成熟以及装配的理解。目前对MDN1结构和功能的了解，较多是基于对酵母Real的研究结论，因此，解析人源MDN1的蛋白质结构，对于阐明包括人类在内的哺乳动物MDN1调控pre-60S核糖体成熟过程的分子机制有着非常重要的意义。本研究通过哺乳细胞表达和蛋白质纯化体系，获得全长人源MDN1蛋白质样品，借助120kV透射电子显微镜和单颗粒（single-particle）重构技术，获得了MDN1蛋白质的负染三维结构模型，为后续解析高分辨MDN1结构奠定了坚实的基础。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1主要试剂和仪器三羟基甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）、氯化钠（NaCl）、氯化镁（MgCl
2
）、甘油（Glycerol）、二硫苏糖醇（DTT）、20×磷酸缓冲液（PBS）、吐温-20（Tween-20）均购自上海生工生物工程公司，cocktail购自瑞士Roche公司，限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶均购自美国Thermo Fisher公司，牛血清白蛋白、dulbecco's modified eagle medium（DMEM）、ANTI-FLAG®M2Agarose Affinity Gel均购自Sigma（上
海）公司，悬浮细胞培养基购自CELL-WISE公司；高速离心机、超速离心机购自美国Beckman Coulter公司，冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，电泳仪与电泳槽购自Bio-Rad（中国）公司，细胞流式分选仪购自美国BD公司，细胞计数仪、高分辨轨道阱质谱仪均购自美国Thermo Fisher公司，激光扫描共聚焦显微镜购自德国ZEISS公司，碳膜铜网购自北京中镜科仪技术有限公司，透射电子显微镜购自美国FEI公司。
1.1.2载体、菌株和细胞pX330-mCherry载体、pUC57载体、E.coli DH5α菌种、Expi293F细胞均由本实验室保存。
1.2实验方法
1.2.1引物合成和DNA序列测定均由上海铂尚生物技术有限公司完成。
1.2.2质粒的构建针对MDN1基因的5'端设计包含sgRNA靶位点（cac cgc aag aag tgc tcc atg acc c）的引物，体外退火后连接入pX330-mCherry载体［27］，作为CRISPR/ Cas9系统［28］gRNA表达质粒。同时构建一段含有MDN1基因起始密码子上游1kb基因组序列，3×FLAG标签（tag）（DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGGSG GS）编码序列，以及下游1kb基因组序列的供体序列，连接在pUC57载体，作为CRISPR/Cas9系统修复供体质粒。
1.2.3FLAG-MDN1细胞株构建将CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达质粒和修复供体质粒同时转染Expi293F细胞，采用DMEM（10%FBS）培养，48h后进行流式分选，将mCherry阳性细胞单克隆分选至96孔板。对存活细胞进行传代培养。存活细胞培养至一定数量后，抽提基因组进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）验证（MDN1-FLAG-for，CTC GGG GTG AGG GCC CTG GGT CGC CAC CAT GGA CTA CAA GGA CCA CGA CGG；MDN1-doner-rev，ACT CAC CTG TCC CGT GGC TCA CG）；全细胞裂解液用FLAG抗体进行蛋白质印迹法（Western blotting）验证。阳性细胞扩大培养至悬浮状态，悬浮细胞在无血清悬浮培养基，37℃、5%CO
2
、140rpm条件下培养。在细胞密度约为3×106/ mL的条件下收取，后进行蛋白质纯化。
1.2.4免疫荧光（immunofluorescence，IF）鉴定提前24h将细胞培养在玻片上。将培养基吸掉，用4%多聚甲醛室温固定20min，PBST（PBS+0.5%聚乙二醇辛基苯基醚，TritonX-100）处理15min，封闭液（5%BSA+ PBS+0.1%TritonX-100）封闭30min，加FLAG一抗4℃孵育过夜。用PBST洗3次，加荧光二抗，室温孵育40 min。之后用PBST洗3次，加DAPI室温染5min，封
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许云涛，等人源MDN1蛋白质的电镜结构研究
片。之后在共聚焦显微镜上观察。
1.2.5MDN1蛋白质纯化表达目的蛋白质的Expi293F
细胞用1000×g离心20min，弃上清，用裂解缓冲液（50mmol/L pH7.5Tris-HCl、400mmol/L NaCl、1mmol/ L MgCl
2
、10%Glycerol、1mmol/L DTT、cocktail）重悬，采用液氮冻存法冻存细胞，液氮研磨法裂解细胞。细胞裂解后经39190×g离心50min，取上清与ANTI-FLAG®M2 Agarose Affinity Gel在4℃低速旋转混合4h，Gel用洗涤缓冲液（50mmol/L pH7.5Tris-HCl、400mmol/L NaCl、
1mmol/L MgCl
2
、10%Glycerol、1mmol/L DTT）洗去杂蛋白质，再用含200ng/μL FLAG Peptide的洗脱缓冲液（50mmol/L pH7.5Tris-HCl、120mmol/L NaCl、
1mmol/L MgCl
2
、1mmol/L DTT）洗脱目的蛋白质。将蛋白质样品用100kD浓缩管浓缩至200μL，通过10%~30%甘油密度梯度离心法，用SW60转子，184500×g，4℃，14h分离纯化目的蛋白质。结束后每200μL收集，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析鉴定目的蛋白质。1.2.6蛋白质组分的质谱鉴定由于许多样品中加有去污剂，需要事先沉淀洗涤处理之后才能上机。样品的处理方法步骤如下：首先沉淀样品去除样品中去污剂如TritonX-100，乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P40，NP40），十二烷基-beta-D-麦芽糖苷（N-Dodecyl-β-D-maltoside，DDM）等。之后重新溶解样品，还原烷基化，用胰蛋白酶，37℃酶解过夜。最后对酶解溶液进行脱盐处理，通过液相谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）进行分析；质谱原始数
据提交到Proteome Discoverer2.3软件中，使用UniProt数据库中的人（Homo sapiens）蛋白质数据库进行检索。1.2.7负染样品制备、数据收集及模型构建因甲酸双氧铀（uranyl formate，UF）溶液渗透能力较强并且颗粒非常细腻，故选择其作为样品的负染液。负染电镜实验步骤如下：对碳膜铜网进行亲水化处理后，取3μL蛋白质溶液滴于碳膜铜网，吸附1min；用滤纸从碳膜铜网边缘轻轻吸去多余的溶液，滴加10μL UF负染液（ρ= 0.75%），洗2次，染1min；用滤纸吸去多余液体，室温晾干；晾干后将样品置于120kV透射电镜中观察，放大倍数设置为57000倍，欠焦值设置为−1~−2μm；选择样品颗粒分散性和均一性较好的区域进行数据收集。随后利用数据处理软件EMAN2［29］和RELION［30］对所收集的图像进行处理并产生一个三维模型。
1.2.8MDN1蛋白质结构预测I-TASSER（Iterative Threading ASSEmbly Refinement）是由密歇根大学开发的在线蛋白质结构与功能预测的工具［31］，预测的原理是不相似的氨基酸序列也可以对应着相似的蛋白质结构。它能从PDB（Protein Data Bank）数据库里识别结构模板，通过基于迭代模板的片段组装模拟来构建完整的结构模型。接着通过蛋白质功能数据库BioLiP对3D模型重新线程化，从而预测靶标的功能。由于MDN1蛋白质较大，只对其6个AAA结构域预测，获得相应的蛋白质三级结构预测数据。
2结果
2.1构建内源表达FLAG-MDN1的细胞株
人源MDN1全长包含5596个氨基酸残基，分子量较大，进行克隆和外源表达的难度非常高，因此我们采用对Expi293F细胞内源敲入标签的方法进行内源表达。在MDN1蛋白质的N端敲入FLAG标签，用于亲和层析（图1A）。通过CRISPR/Cas9对Expi293F细胞MDN1基因组N 端进行定点剪切，再通过带有FLAG标签的修复供体进行修复，然后利用流式细胞术分选mCherry阳性的单克隆Expi293F细胞进行培养。获得的单克隆细胞株抽提基因组DNA进行PCR验证，部分的细胞株样品能够获得预期的特异性PCR产物，说明相应的细胞株已经敲入目的FLAG标签（图1B）。进一步，利用FLAG抗体对全细胞裂解液进行Western blotting分析，结果显示阳性克隆细胞株能够检测到目的条带（图1C），表明带有N端FLAG 标签的MDN1蛋白质可以正确表达。另外我们也采用IF 技术，检测FLAG-MDN1的表达和定位（图1D）。上述3种不同的检测方法，都证实FLAG纯化标签在MDN1蛋白质N端成功敲入，获得正常表达FLAG-MDN1融合蛋白质的Expi293F细胞株。
2.2MDN1蛋白质的纯化
对标签敲入成功的阳性细胞株进行扩大悬浮培养，收取6L细胞（约1.8×1010个细胞）用裂解缓冲液重悬后，采用液氮研磨法破碎细胞。细胞裂解后经高速离心取上清，利用ANTI-FLAG亲和层析方法获得目的蛋白质。纯化富集的蛋白质样品采用Western blotting和银染的方法进行检测（图1E、F），证实得到的样品主要包含目的蛋白质FLAG-MDN1。将纯化样品采用体积分数为10%~ 30%的甘油通过密度梯度离心法进行分离纯化，进一步提高样品的纯度和均一性；密度梯度离心获得的样品按200μL/管进行组分收
集，通过SDS-PAGE和银染鉴定不同的收集组分，选取纯度和均一性较好的样品用于后续的实验（图1G，孔道9~11）。
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上海交通大学学报（医学版）2.3MDN1蛋白质负染电镜数据收集和三维模型的构建在获得高纯度且均一性较好的MDN1蛋白质样品后，
采用负染电镜技术和单颗粒重构技术分析目的蛋白质的三维模型。对碳膜铜网进行亲水化后，将样品吸附到碳膜铜网，经重金属甲酸双氧铀（UF ）染，通过120kV 透射电镜观察，结果表明样品在负染条件下蛋白质浓度合适，颗粒分散性和均一性较好（图2A ）。大部分颗粒的形状为长条形，长度约29nm ，和预期分子量大小基本相符（图2A ）。部分颗粒的形状偏向圆形，可能是MDN1蛋白质6个AAA 结构域的投影。我们在57000放大倍数条件下共收集负染照片103张，运用EMAN2软件手动挑选颗粒，共挑出16103个颗粒，之后使用RELION 软件进行二维分类平均（2D classification ）（图2B ）和三维分类（3D classification ）计算。结果表明MDN1蛋白质结构特征明显（图2C ），用于三维重构的颗粒角度分布均匀（图2D ）。2.4
reaction研究
MDN1蛋白质初步结构分析
负染数据进一步经过三维优化处理（3D auto-Refine ），最终获得分辨率约为45Å的人源MDN1蛋白质负染三维结构模型（图3A ）。整个蛋白质大小为140Å×170Å×340Å（图3B ），其整体轮廓和已报道的酵母源的MDN1蛋白质较为相似［24］。已有的研究预测MDN1蛋白
质含有6个AAA 结构域（图1A ）［10］
，借助I-TASSER 软
件对该结构域进行模拟，结果如图所示（图3C ）；进一步对模拟结果通过UCSF Chimera ［32］自动匹配，大致确定了AAA 结构域在MDN1蛋白质负染结构模型中的位置（图3D ）。将我们的负染三维模型和已报道的酵母源MDN1的蛋白质结构进行比较，发现二者的AAA 结构域
在整体结构中的定位是类似的（图3D ）［24］。这进一步表
明MDN1蛋白质结构在酵母和人之间是较为保守的。
3讨论
由于核糖体在细胞中的重要性，其装配成熟过程一直
是相关研究领域的一个热点问题。已有的研究表明，AAA-ATPase 在pre-60S 核糖体成熟和出核过程中发挥着重要作用［10］。尽管MDN1功能有一些研究报道，也有研究者在2018年发表了酵母源MDN1的高分辨率结构［24-25］，但是人源MDN1的结构研究进展缓慢，目前尚无任何高分辨率结构的报道，这限制了研究人员对MDN1在哺乳动物pre-60S 核糖体成熟过程中发挥作用的分子机制的理解。虽然氨基酸序列分析表明酵母源与人源MDN1蛋白质在某些结构域有一定的保守性，但有研究认为人源MDN1在pre-60S
核糖体成熟过程中被招募的机制可能有所不同，与其
Note ：A.Schematic representation of MDN1domain organization.FLAG tag was inserted into the N-terminus of MDN1.B/C.Verification of the knock-in of FLAG tag by
PCR (B)and Western blotting (C).NC —negative control;F —FLAG tag knock-in cell lines.The arrow indicates expected PCR products or protein bands.D.IF detection of endogenous FLAG-tagged MDN1protein.E/F.Western blotting analysis and silver staining of purified FLAG-MDN1.G.Silver staining of protein fractions after density gradient centrifugation.1‒20—protein fractions.图1人源内源FLAG-MDN1蛋白质纯化
Fig 1Purification of the human endogenous FLAG-tagged MDN1protein
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许云涛，等人源MDN1蛋白质的电镜结构研究
Note ：A.A representative negative-staining electron micrograph image of MDN1.B.Selected reference-free 2D class averages.C.Reconstruction of MDN1protein shown in six orthogonal views as indicated.D.Angular distribution of the particles used for the final reconstruction.图2负染电镜分析MDN1蛋白质
Fig 2Negative-staining electron microscopy analysis of
MDN1
Note ：A.Gold standard Fourier shell correlation (FSC)curve of the final reconstructed electron micrograph map of MDN1.B.Surface view of the electron micrograph map of MDN1and its volume size.C.Predicted atomic model of MDN1AAA domains (amino acids —307-2313).D.Docking of the predicted atomic model of AAA domains into corresponding mass of MDN1shown in two orthogonal views.图3MDN1蛋白质三维模型和AAA 结构域的定位
Fig 3Three-dimensional reconstruction of MDN1and localization of AAA domains
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