illumina 转录组测序简明实验流程一、实验基本流程图
mRNA Library Construction
二、mRNA建库流程
1.材料准备
1.2.
1.3.
2.样品准备和QC
选择质量合格的Total RNA作为mRNA测序的建库起始样品，其质量要求通过Agilent 2100 BioAnalyzer检测结果RIN≥7，28S和18S的RNA 的比值大于或等于1.5：1，起始量的要求范围是0.1∽1ug。用QUBIT RNA ASSAY KIT对起始的Total RNA进行准确定量。
3.建库实验步骤
reaction buffer
3.1.mRNA纯化和片段化
3.1.1.mRNA纯化
纯化原理是用带有Oligod(T)的Beads对Total RNA中mRNA进行纯化。
3.1.2.mRNA片段化
3.2.1st Strand cDNA 合成
3.3.2nd Strand cDNA 合成
根据下表制备反应体系，然后在PCR仪上运行Program3，然后将第2链cDNA合成产物用144uL AMPure XP Beads进行纯化，最后用60µL的Nuclease free water进行重悬，取出
55.5µL以备下一步使用;
3.4.Perform End Repair/dA-tail
3.5.Adaptor Ligation
根据下表制备反应体系，然后在PCR仪上运行Program5、Program6，然后100uL AMPure XP Beads进行纯化后用52.5µL的Resuspension Buffer进行重悬，再用50uL AMPure XP Beads
3.6.PCR扩增
根据下表制备反应体系，然后在PCR仪上运行Program7，然后再45µL用AMPure XP Beads 进行纯化，最后用23µL的Resuspension Buffer进行重悬，取出20µL以备下一步使用；
3.7. PCR 产物质控
用QUBIT DNA HS ASSAY KIT 对PCR 产物进行准确定量。 (1) 2100质控
用2100 Bioanalyzer chip 判断PCR 切胶产物片段大小是否符合后续测序的要求。 (2) 文库摩尔浓度准确定量
通过q-PCR 标准品的摩尔浓度对构建的文库进行摩尔浓度的绝对定量，以保证文库上机用量的准确性，采用Illumina 推荐的KAPA 定量试剂盒（Cat no.KK4602）。
3.8. 混合文库 (Optional)
根据文库的定量及定性结果将每个library 的摩尔浓度统一调整到2nM ，然后根据实验设计选择性的将需要混合的library 进行等量等浓度混合，保证混合后的library 的终浓度也是2nM
，体积大于等于10µL ，然后将文库进行-80℃保存。 三、上机测序 1. 材料准备 1.1.
1.2. 2. 文库上机样品准备
2.1. 准备新鲜配置的NaOH ，将其浓度调整到0.1N ；取0.1N 的NaOH （10µL）与2nM 的文库（10µL）
的进行混合vortex ，离心，室温放置5min ，然后冰上放置；
2.2. 然后将20µL 已经变性成单链DNA 的Library 加入到980µL 预冷的HT1(Hybridization buffer)
中，使文库的终浓度为20pM ，冰上放置；

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。