第58卷第11期Vol．58
No．11山东大学学报（医学版）
JOUＲNAL OF SHANDONG UNIVEＲSITY （HEALTH SCIENCES ）
2020年11月Nov．2020
收稿日期：2020-08-04；网络出版时间：2020-10-1508：48：04网络出版地址：http ：//kns．cnki．net /kcms /detail /37．1390．Ｒ．20201014．0852．002．html 通信作者：庄学伟。E-
mail ：152****9381@163．com 文章编号：1671－7554（2020）11－0071－05
DOI ：10．6040/j．issn．1671-
7554．0．2020．1127
外泌体lncＲNA OGFＲP1在84例非小细胞肺癌中的表达及临床意义
刘小璟，夏西燕，肖珂，陈文丹，庄学伟
（山东大学齐鲁医院检验科，山东济南250012）
摘要：目的探讨长链非编码ＲNA （lncＲNA ）OGFＲP1在非小细胞肺癌（NSCLC ）血清外泌体中的表达及临床意义。方法
分别对84例初诊为NSCLC 的患者及84例正常健康者的血清进行外泌体提取鉴定、
ＲNA 提取及检测lncＲNA 表达。统计学分析血清外泌体lncＲNA OGFＲP1诊断NSCLC 的灵敏度、特异度与准确性，分析lncＲNA OGFＲP1的表达与临床病理特征的关系。结果
84例初诊为NSCLC 的患者均经病理学证实为NSCLC 。lncＲNA
OGFＲP1在NSCLC 血清外泌体中显著高表达（χ2=96．459，P ＜0．001）。以病理诊断为金标准，ln
cＲNA OGFＲP1测值对NSCLC 的辅助诊断的灵敏度、特异度和准确性分别为90．5%、86．9%和93．9%，高于癌胚抗原，差异有统计学意义（P ＜0．001）。血清外泌体lncＲNA OGFＲP1的相对表达量与NSCLC 癌患者的淋巴结转移（P =0．034）以及T 分期（P =0．030）差异有统计学意义。结论
血清外泌体lncＲNA OGFＲP1的检测对于诊断NSCLC 具有较高的灵
敏度、特异度和准确性，可作为NSCLC 早期筛选、检测和分期的新型肿瘤标志物。关键词：非小细胞肺癌；长链非编码ＲNA OGFＲP1；外泌体；癌胚抗原中图分类号：Ｒ734．2
文献标志码：A
Expression and clinical significance of exosomal long non-coding ＲNA
OGFＲP1in 84cases of non-small cell lung cancer
LIU Xiaojing ，XIA Xiyan ，XIAO Ke ，CHEN Wendan ，ZHUANG Xuewei
（Department of Clinical Laboratory ，Qilu Hospital of Shandong University ，Jinan 250012，Shandong ，China ）Abstract ：Objective
To explore the expression and clinical significance of long non-coding ＲNA （lncＲNA ）OGFＲP1
in serum exosomes of non-small cell lung cancer （NSCLC ）．Methods
A total of 84cases preliminarily diagnosed as
NSCLC and 84healthy controls were enrolled．The serum exosomes were extracted and identified ，the ＲNA was extrac-ted ，and lncＲNA expression was detected．The sensitivity ，specificity and diagnostic accuracy of lncＲNA OGFＲP1were statistically analyzed．The relationship between the lncＲNA OGFＲP1expression and clinicopathological factors were analyzed．Ｒesults
All cases were pathologically confirmed as NSCLC．lncＲNA OGFＲP1was highly expressed in
NSCLC （χ2
=96．459，P ＜0．001）．With pathological diagnosis as the gold standard ，the sensitivity ，specificity and accuracy of lncＲNA OGFＲP1in the auxiliary diagnosis of NSCLC were 89．4%，
87．9%and 89．4%，respectively ，high-er than those of carcino-embryonic antigen （P ＜0．01）．The relative expression of lncＲNA OGFＲP1in serum exosomes was significantly associated with lymph node metastasis （P =0．034）and T stage （P =0．030）in NSCLC patients．Conclusion
The detection of exosomal lncＲNA OGFＲP1has high sensitivity ，specificity and accuracy in the diagnosis
of NSCLC ，which can be used as a novel tumor marker for early screening ，diagnosis and staging of NSCLC．Key words ：Non-small cell lung cancer ；Long non-coding ＲNA OGFＲP1；Exosome ；Carcino-embryonic Antigen
72山东大学学报（医学版）58卷11期
肺癌是发病率最高的恶性肿瘤，肺癌导致的死亡人数占所有癌症死亡人数的24%［1］，而非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）又占全部肺癌的80%［2］。近年来，虽然NSCLC的诊疗技术有了很大的进步，但其5年存活率仍仅有13%左右［3］。随着基因测序技术与肿瘤生物学的发展，以基因诊断和分子靶向为特征的个体化已成为NSCLC的一种有前途的诊疗手段［4-5］。因此，寻新的诊疗分子靶点，对于NSCLC的早期诊断与预后判断具有十分重要的意义。目前针对NSCLC 的分子靶向主要是通过单克隆抗体或者药物来靶向使NSCLC中的相关基因发生突变或者蛋白过度表达，然而在人类基因组中蛋白编码基因只占2%，绝大部分为非编码基因［6-7］。研究发现长链非编码ＲNA（long non-codingＲNA，lncＲNA）在基因表达调控以及染质结构重塑等方面均发挥重要的调节作用，外泌体中的miＲNA、lncＲNA在肺癌组织中的表达与作用也有报道［8］，然而针对NSCLC血
清外泌体lncＲNA标志物的研究仍十分缺乏。本研究利用基因表达谱交互网（geneexpression profiling interactive Analysis，GEPIA）筛选与NSCLC发病及患者生存率相关的lncＲNA［9］，发现OGFＲP1作为lncＲNA家族中的一员，在肺腺癌组织中显著表达，而NSCLC患者外泌体lncＲNA OGFＲP1的表达情况及意义罕有报道。本研究以lncＲNA OGFＲP1作为分子生物标志物指标，旨在探讨其在NSCLC患者的早期诊断与预后判断中的临床意义。
1资料与方法
1．1资料
1．1．1临床资料收集2019年9月至2020年6月在山东大学齐鲁医院血液标本库中初诊为NSCLC 的患者血清标本84例（NSCLC），所有初诊为NSCLC的患者均未接受手术、放化疗等任何方法，检测后的术后病理均证实为NSCLC。另收集本院健康体检人血清标本84例作为健康对照组。本研究通过了山东大学齐鲁医院伦理委员会的批准，所有参与者均签署了知情同意书。
1．1．2主要试剂SBI ExoQuick Exosome Isolation Ｒeagent试剂盒（美国SBI公司）、miＲNeasy Micro Kit50试剂盒（德国QIAGEN公司）、SureScrip First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（美国Genecopoe-ia公司）、BlazeTaq SYBＲGreen qPCＲMix2．0试剂盒（美国Genecopoeia公司）。1．2方法及结果判定
1．2．1外泌体的分离收集1．5mL血清3000g离心15min，离心半径为80mm，下同。将250μL上清液移至无菌1．5mL EP管中，加入63μL外泌体沉淀液轻弹混匀。将混合后的血清4ħ保持直立放置30min，室温下将混合物以1500g离心30min；去上清再以1500g离心5min，彻底去除液体，沉淀中即外泌体，以100μL无菌1ˑPBS重悬外泌体待用。
1．2．2外泌体的鉴定利用电镜对提取的外泌体进行鉴定。
1．2．3总ＲNA提取向重悬外泌体中加700μL QIAzol裂解试剂，室温15 25ħ孵育5min；加入140μL氯仿，混匀15s后室温孵育2 3min；在4ħ下以12000g离心15min，收集上清液400μL，加入600μL无水乙醇彻底混匀；吸500μL样品至2mL 收集管ＲNeasyMinElutespin柱中，室温下8800g离心15s，弃废液，取剩余样本重复上一步骤。将700μL ＲWT试剂加入柱中，室温下8800g离心15s，弃废液；将500μL缓冲液ＲPE试剂加入柱中，室温下8800g离心15s，弃废液；加500μL80%乙醇到柱中，室温下8800g离心2min，弃废液；将柱置于新2mL收集管中，13000g离心5min使膜干燥；将柱置于1．5mL新收集管，加入18μL双蒸水（ddH2O）至膜中心，放置3min以提高ＲNA产量，13000g离心1min，收集ＲNA，保存于－80ħ待用。
1．2．4总ＲNA浓度及纯度测定采用NanoDrop 2000C紫外可见光光度计（美国Thermo Evolution 公司）检测ＲNA OD260/OD280值，对提取样品中的总ＲNA浓度及纯度进行评估。
1．2．5ＲNA逆转录合成cDNA采用SureScrip First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行ＲNA逆转录，操作过程均在冰上进行。反应体系为20μL：1μL SureScripＲTase Mix（20ˑ），4μL SureScripＲT Ｒeaction Buffer（5ˑ）15μL提取的总ＲNA。反应条件：25ħ5min，42ħ15min，85ħ5min，4ħ持续。将cDNA进行5倍稀释后保存于－20ħ待用。1．2．6qＲT-PCＲ检测lncＲNA分子表达采用BlazeTaq SYBＲGreen qPCＲMix2．0试剂盒进行反应，操作过程均在冰上进行，每组实验重复3次。反应体系为20μL：4μL5ˑBlazeTaq qPCＲMix，2μL PCＲforward primer（2μm），2μL PCＲreverse prim-er（2μm），2μL cDNA，10μL ddH
2
O。反应条件：95ħ预变性30s，40个循环于95ħ变性10s、60ħ退火延伸30s，添加溶解曲线，从72ħ逐渐增加至
刘小璟，等．外泌体lncＲNA OGFＲP1在84例非小细胞肺癌中的表达及临床意义
73
95ħ，以人GAPDH 为内参照。lncＲNA OGFＲP1的上游引物：5'-TGGGGAGGGCCTTAAAACAG-3'下游引物：5'-TCTGTGGGACCCTGTGAAAC-3'。1．2．7血清CEA 含量测定CEA 含量测定使用的是电化学发光法，应用罗氏cobas e601电化学发光
全自动免疫分析系统和原装进口试剂测定，严格按照说明书进行操作。癌胚抗原（CEA ）的正常参考范围是0 5U /mL 。1．3
统计学处理采用SPSS 22．0、
Graphpad prism7．0和MedCalc19．4软件进行分析和绘图。本
研究的临床实验数据通过2－△△CT
公式进行计算分
析得到lncＲNA OGFＲP1相对表达量，lncＲNA OGFＲP1的相对表达量经Kolmogorov-Smirnov 检验
为计量资料的非正态分布，故两组间比较采用Mann-Whitney U 检验，多组比较采用Kruskal-Wal-lis 检验，测量值以中位数及4分位值描述。根据lncＲNA OGFＲP1相对表达量和CEA 血清含量绘制受试者工作曲线（receiver operating characteristic curve ，ＲOC ），约登指数（灵敏度+特异度-1）用于确定cut-off 值。检验标准P ＜0．05为差异有统计学意义（双尾）。
2
结果
2．1
总ＲNA 检测结果
对NSCLC 患者血清提取
的总ＲNA 进行光密度比值测定，
总ＲNA 浓度范围为30 50ng /μL ，OD 260/OD 280值均在1．8 2．1之间。2．2
外泌体鉴定结果见图1。通过电镜法对提取
外泌体进行鉴定，透射电镜下显示外泌体直径为
30 200nm ，具有双圆盘结构的囊泡
。
图1外泌体电镜鉴定结果
Fig．1Electron microscopy identification of exosomes
2．3
lncＲNA OGFＲP1在NSCLC 患者血清外泌体中的相对表达水平见图2。血清外泌体lncＲNA
OGFＲP1在NSCLC 患者和健康对照组中均表达，
NSCLC 组表达水平比健康对照组表达水平升高，差
异有统计学意义（χ2
=96．459，P ＜0．001）
。
图2
血清外泌体lncＲNA OGFＲP1在两组的相对表达量
（＊＊P ＜0．001vs 健康对照组）Fig．2Ｒelative expression of serum exosomal lncＲNA
OGFＲP1in two groups （＊＊P ＜0．001vs healthy con-trol group ）
2．4
NSCLC 患者血清外泌体lncＲNA OGFＲP1相
对表达量与临床病理特征的关系见表1。NSCLC
患者血清外泌体lncＲNA OGFＲP1的相对表达量与淋巴结转移（P =0．034）以及T 分期（P =0．030）差异有统计学意义，而lncＲNA OGFＲP1的相对表达量与肿瘤分化程度、年龄、性别差异均无统计学意义（P ＞0．05）。
表1
lncＲNA OGFＲP1在NSCLC 患者中的表达与临床病理特征关系
Tab．1Ｒelationship between expression of lncＲNA OGFＲP1and clinicopathological characteristics in NSCLC patients 病理参数例数
lncＲNA OGFＲP1
相对表达量a
P
χ
2
年龄（岁）0．31240．660
＜6042
0．566（0．185 2．333）≥6042
0．419（0．242 1．225）
性别（n ）0．160
1．976男480．463（0．222 0．918）女
360．901（0．217 5．062）
分化程度（n ）0．129
4．089高分化260．339（0．165 0．983）中分化190．243（0．396 0．751）低分化390．789（0．264 2．906）
T 分期（n ）0．030
8．961T1420．345（0．150 1．025）T2130．890（0．349 5．434）T3210．548（0．326 5．249）T4
80．637（0．352 5．240）
淋巴结转移（n ）0．034
8．676N0280．202（0．106 0．894）N1110．909（0．327 2．113）N2280．719（0．314 5．249）N3
17
0．575（0．367 1．150）
a
测量值以中位数及4分位值描述
74山东大学学报（医学版）58卷11期
2．5血清外泌体lncＲNA OGFＲP1在NSCLC患者中的诊断效能见图3。根据NSCLC患者和健康对照组的血清外泌体lncＲNA OGFＲP1相对表达量绘制ＲOC曲线，得到其Cut-off值为0．774，lncＲNA OGFＲP1的曲线下面积（AUC）为0．939（95%CI：0．902 0．976，P＜0．001），灵敏度及特异度分别为90．5%、86．9%。根据NSCLC组和健康对照组的血清CEA含量绘制ＲOC曲线，得到其Cut-off值为0．512，AUC为0．788（95%CI：0．718 0．859，P＜0．001），其灵敏度及特异度分别为67．9%、83．3%。两者ＲOC曲线面积之差为0．151，Z统计量为3．751，P＜0．001，lncＲNA OGFＲP1与CEA的诊断价值差异存在统计学意义，证明lncＲNA OGFＲP1比CEA的诊断价值高
。
图3血清外泌体lncＲNA OGFＲPl相对表达量和血清CEA 含量诊断NSCLC的ＲOC曲线
Fig．3ＲOC curve of the relative expression of lncＲNA OGFＲPl and serum CEA in the diagnosis of NSCLC 3讨论
NSCLC是所有癌症中基因组学上最为多样化和复杂性的疾病之一，且随疾病的发展其基因组与转录组也呈现动态变化［10］，对NSCLC的预防和形成了巨大的挑战。文献显示40%的NSCLC患者被诊断
时已经发展为晚期或转移性肿瘤，导致无法手术切除［11］，因此，早期诊断NSCLC有着重要的临床意义。
外泌体是一种细胞分泌的、直径约为40 150nm、具有脂质双层膜结构的微小膜泡，广泛存在于血液、尿液、羊水、唾液、脑脊液等体液中［12-14］。而外泌体中包含信使ＲNA、微小ＲNA和蛋白质等内容物，其在细胞相互之间是一种稳定而有效的信号传递交换方式，有了外泌体的保护，这些内容物变得相对不易被降解［15-16］。因此，通过提取外泌体中的内容物来进行检测，结果可以更加准确有效。
lncＲNA是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白的ＲNA［17］。lncＲNA具有组织特异度高、动态表达等特点，非常适合对NSCLC的动态化个性化的［18-19］。研究显示，lncＲNA对肿瘤增殖、凋亡等重要信号通路蛋白表达的调控是其发挥作用的重要方式［20 22］。Weber等［23］发现，MALAT-1可作为NSCLC诊断的血液生物标志物，在区分癌症患者和无癌对照时具有56%的灵敏度和96%的特异度。Yu等［24］通过微阵列基因表达分析鉴定并验证了64个在正常肺组织中与NSCLC肿瘤显著失调的lncＲNAs以及在NSCLC不同亚型具有特异度表达的181个lncＲNAs。Wang等［25］鉴定出5种能鉴别早期肺腺癌与正常组织样本的lncＲNAs，并且具有高灵敏度和特异度。但是，上述研究均存在一些不足，例如，灵敏度不高，需要取材肿瘤组织或肺组织，不具备无创、早期的筛查作用。本研究在前期筛选出与NSCLC发病及患者生存率相关的lncＲNA基础上，进一步研究NSCLC患者血清外泌体lncＲNA OGFＲP1的表达情况。本研究结果显示，血清外泌体lncＲNA OGFＲP1在NSCLC患者和健康对照组中
均表达，但是，NSCLC组表达水平显著高于健康对照组。另外，NSCLC患者血清外泌体lncＲNA OGFＲP1的相对表达量与淋巴结转移以及T分期的差异均有统计学意义，提示血清外泌体lncＲNA OGFＲP1的相对表达量越高，有可能淋巴结转移越多以及T分期越晚。因此，NSCLC患者血清外泌体lncＲNA OGFＲP1的相对表达量具有一定临床分期参考价值。
血清CEA是常用的肿瘤标志物，对于NSCLC 的诊断具有一定参考价值，但它对NSCLC的灵敏度与特异度较差。本研究结果显示，血清外泌体lncＲNA OGFＲP1对NSCLC的灵敏度、特异度和准确性分别为90．5%、86．9%、93．9%，而血清CEA的灵敏度、特异度和准确性分别为67．9%、83．3%、78．8%，统计学分析显示lncＲNA OGFＲP1与CEA的诊断价值存在统计学差异，提示lncＲNA OGFＲP1的诊断效能可能高于CEA，为进一步研究提供了基础。
综上所述，血清外泌体lncＲNA OGFＲP1具有比CEA更高的灵敏度、特异度与准确性，可以作为一种更为准确的简单安全的早期筛查手段，对于早期筛查NSCLC具有较高的实用价值，可与CT相互补充印证，达到早期发现NSCLC的目的。此外，血清外泌体lncＲNA OGFＲP1的高表达与NSCLC患
刘小璟，等．外泌体lncＲNA OGFＲP1在84例非小细胞肺癌中的表达及临床意义75
者肿瘤的分期与淋巴转移呈正相关，具有预测患者预后的潜在价值。
致谢：本文中统计学分析是在山东大学公共卫生学院生物统计学系李秀君教授的指导下完成的，在此表示衷心的感谢！
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（编辑：刘霞）

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