第6章 CpLTP3、CpLTPI.4基因启动子克隆及瞬时表达分析
  为了深入探索蜡梅nsLTPs基因家族4个成员CpLTP1、CpLTP2、CpLTP3 、CpLTP4在表达和功能上存在差异的原因，需要进一步克隆各个成员的启动子，以便寻调控方面的差异。我们利用hiTAIL-PCR法分离得到了CpLTP3、CpLTP4基因的启动子区域，并对调控原件和瞬时表达活性进行了分析，另外两个基因启动子暂时没有得到成功分离，所以没有进行分析。
6.1 实验材料
6.1.1 植物材料
供试蜡梅开花大树品种为罄口蜡梅，种植于西南大学校园内,常规管理。蜡梅小苗通过种子繁殖培育，种子采自西南大学校园罄口蜡梅树。培养条件为湿度85％，16h光照(2000Lx)，温度25℃，8h黑暗，温度20℃。烟草W38（Nicotiana tobacum cv. Wisconsin 38）由本实验室保存扩繁。
6.1.2 菌种和载体
大肠杆菌（Esherichia coli）菌株TOP10，为质粒转化受体菌由本实验室保存。
根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacieus）LBA4404，用于农杆菌介导的烟草遗传转化，由本实验室保存。
克隆载体pMD19-T购自TaKaRa公司。植物表达载体pBI121，具有Km抗性和完整的GUS基因表达元件，用于构建瞬时表达载体。
6.1.3 主要试剂
Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶、Mgcl2、dNTP、T4 DNA连接酶等购自TaKaRa公司；DL2000、DNA Maker、质粒提取和胶回收试剂盒均购自BioFlux公司；PCR引物合成及DNA测序均由生物工程有限公司合成；氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)和卡拉霉素(Kanamycin,Km)均购自上海生物工程有限公司。
6.1.4 主要设备
紫外分光光度仪（岛津），高速冷冻离心机（HITACHI），台式冷冻离心机（Eppendoff），TGL-16B型台式离心机（上海安亭），Eppendorf PCR仪，IKA型涡旋器（德国产），高压灭菌锅（日本产），超低温冰箱（sanyo），DYY型电泳仪（北京六一厂），超净工作台（苏州净化设备厂）， FR-1型凝胶成像系统（上海复日），722型分光光度计（重庆川仪九厂），恒温振荡摇床，恒温培养箱，水浴锅。
6.1.5 常用溶液配方
氨苄青霉素（Amp）：水溶，超滤，贮存浓度50mg/mL，﹣20℃避光保存。
卡那霉素（Km）：水溶，超滤，贮存浓度50mg/mL，﹣20℃避光保存。
TE（pH8.0）：10mmol/L Tris-Cl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0）。
50×TAE(电泳缓冲液),1L：Tris 242g/L,冰醋酸57.1ml, EDTA(0.5mol/L pH 8.0)100ml/L 。
6×琼脂糖凝胶上样缓冲液：溴酚蓝 0.25%（W/V），蔗糖40%（W/V）。                             
6.1.6基本培养基配方
（1） LB培养基（培养大肠杆菌用）
参照3.1.5
________________________________________________________________________________________________________________________________动子的160_________________________________________________________________________________________________________________________（2）YEB培养基（培养农杆菌用）               
Trptone        1%（W/V）       
Yeast extract      0.1%（W/V）
MgSO4·7H2O      0.5g/L             
蔗糖            0.5%（W/V）
pH                7.0               
(固体培养基加1.5%的琼脂)
（3）烟草转化基本培养基
MS0：MS 基本成分+蔗糖30g/L，pH5.8
MS1(高盐胁迫培养基)：MS0+1mol·L-1 NaCl；pH5.8
MS2(干旱胁迫培养基)：MS0+25%的PEG6000, pH5.8
MS3(脱落酸胁迫培养基)：MS0+100mMABA, pH5.8
MS4(赤霉素胁迫培养基)：MS0+100mMGA3
每种处理3瓶，重复3 次
（5）GUS染液
1）0.5M MES（pH5.6）
9.76g MES(啉乙磺酸钠)溶解于100ml MQ-water中,调pH5.6
2）固定液(0.3%甲醛，10mM MES pH5.6,0.3M甘露醇)
3）750ul甲醛，2ul 0.5M
MES,5.46g甘露醇，加水至100ml
4）50mM NaPO4 Buffer(pH7.0)
57.7ml 1M Na2HPO4,42.3ml 1M NaH2PO4,加水稀释至2000ml
5） 组织化学染试剂X-Gluc
将10g X-Gluc溶解于100ul的二甲基甲酰胺中，加50mM NaP04(pH7.0)至10ml
6）70%的乙醇。
6.2 实验方法及操作过程
6.2.1蜡梅基因组DNA的提取、纯化
    蜡梅DNA的提取、纯化见3.2.2
6.2.2 hiTAIL-PCR法扩增启动子序列
（1） 引物设计
用Liu等人改良的TAIL-PCR: hiTAIL-PCR法扩增蜡梅非特异性脂转移蛋白基因的启动子[280]。以已克隆到的腊梅CPLTP3和CPLTP4基因5’端序列为基础，分别设计3条特异的巢式引物RB0,RB1,RB2，结合简并引物LAD、及AC0/AC1，分别进行三轮扩增。
LAD1: 5′-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA-3′
LAD2: 5′-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT-3′
LAD3: 5′-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAC-3′
LAD4: 5′-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCCAA-3′
LAD5: 5′-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCGGT-3′
AC0: 5′-GGACGATGGACTCCAG-3′
AC1: 5′-ACGATGGACTCCAGAG-3′
CPLTP3RB0: 5′- GACGCTACCTGCCCACACGTGATTG -3′
CPLTP3RB1:5′-ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCCACGTGAGGAGAGGCCAACAGCAA -3’
CPLTP3RB2:5′-CAGCATCAGGCACACAACAACTCCG -3′
CPLTP4RB0: 5′- CCGGTTCTACTTGTTGAATGGGTGG -3′
CPLTP4RB1:5′-ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCTACATGCTGCACCGGCACAGGCGC -3′
CPLTP4RB2: 5′-CAGAGTGTTGCGTCGGTGCCATTGC-3′
（2） hiTAIL-PCR过程
以50ng的蜡梅基因组DNA为模板，用3个特异性的巢式引物和简并引物LAD1-5,AC0，AC1为引物对,进行TAIL-PCR扩增。将预扩增的PCR产物稀释50被作为第一轮PCR扩增的模板，第一轮PCR。各轮PCR反应体系及反应条件见表6-1。
表6-1　TAIL-PCR的扩增体系、反应条件
Table 6-1　Amplif ication condition for TAIL -PCR
反应                  循环体系                  温度条件（时间）                循环数
Reaction              Cycling system /μL          Temperature condition ( Time)            Cycle No.
                      10 Ex-Taq Buffer      2        93℃ (2min) , 95 ℃(1min)                1
                      25mM MgCl2            1.6      94℃ (30s) , 60℃ (1 min) 72℃(1min)        10
预扩增            2.5 mM dNTP        1.6      94℃ (30s) , 25℃ (2min) , 72℃(3min)        1
Pre-amplification        20MLAD            1        94℃ (20s) , 48℃ (1min) , 72℃(3min)        25
                      6MAC0            1        72℃ (5min)                            1
6MRB0            1
genomic DNA        1
TaKaRa Ex-Taq DNAase    0.1
      ddH2O  up  to      20
第一轮扩增        10 Ex-Taq Buffer      2.5
Primary reaction      25mM MgCl2              2        94℃ (20s) , 65℃ (1min) , 72℃(2min)        1
              2.5 mM dNTP          2        94℃ (20s) , 68℃ (1min) , 72℃(3min)
reaction buffer                    6M AC1              1        94℃ (20s) , 68℃ (1min) , 72℃(3min)
                    6M RB1              1        94℃ (20s) , 50℃ (1min) , 72℃(3min)        13
                501st PCR  product      1        72℃(5min)                              1
TaKaRa Ex-Taq DNAase    0.2
                    ddH2O  up  to      25
第二轮扩增        10 Ex-Taq Buffer      2.5
Secondary reaction    25mM MgCl2              2        94℃ (20s) , 68℃ (1min) , 72℃(3min)
              2.5 mM dNTP          2        94℃ (20s) , 68℃ (1 min) , 72℃(3min)
                    6M AC1            1        94℃ (20 s) , 50℃ (1 min) , 72℃(3min)        7
                    6M RB1            1        72℃(5min)                              1
                102st PCR  product      1
TaKaRa Ex-Taq DNAase    0.2
                    ddH2O  up  to      25
  用1％琼脂糖胶电泳。预扩增产物通常为涂抹状，在检查少数样品后，不必对所有预扩增产物电泳检测。同一样品的第一轮和第二轮产物在相邻的泳道电泳，特异产物产生相应的大小差异。将获得的PCR产物连接转化后送上海生工测序。
6.2.3 CpLTP3pro , CpLTP4pro启动子片段的获得
根据CpLTP3pro , CpLTP4pro启动子序列，设计含有HindIII和BamHI酶切位点的扩增引物：
FCpLTP3pro: 5′- AAGCTT ATTACGATGGACTCCAGAGCGGC-3′
      RCpLTP3pro: 5′-GGATCCCTCCGCTTACTTACTCAGTCACACT-3′
      FCpLTP4pro：5′- AAGCTT ATTACGATGGACTCCAGAGCGGC-3′ 
RCpLTP4pro：5′-GGATCCTTGATGGATTTCACAGAGAATTG-3′
以蜡梅基因组DNA为模板进行 PCR扩增，25μl体系：
10ExTaq Buffer                  2.5L
MgCl2                                        1.5L   
dNTP                            1.0L
DNA                            1.0L
FCpLTPpro引物                  1.0L               
RCpLTPpro引物                  1.0L     
Ex Taq DNA聚合酶                0.5L (1U)
ddH2O                          16.5µL
Total                              25.0µL
PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性45s，60℃退火45s, 72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。
6.2.4克隆载体pMD- CpLTP3pro和pMD- CpLTP4pro的构建

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