Caspase3 测定
caspase-3的检测方法：
(1)免疫细胞化学检测caspase-3蛋白的表达，用悬浮的细胞；
(2)western blot 理想结果：caspase-3有32ＫＤ的条带外，还出现了20ＫＤ和10ＫＤ大小的条带，表明caspase-  3被活化；
(3)RT-PCR检测mRNA的表达，用凝胶成像分析系统处理，可以半定量。
Caspases可以在哺乳动物细胞内启动凋亡，caspase3比蛋白酶试剂盒通过简单、方便的测定caspases活性的方法这种方法通过识别序列DEVD，这种方法基于用分光光度计测定从标记底物DEVD-pNA分开的发团（pNA) 此时游离的pNA的发射光谱可用分光光度计或酶标仪或微量滴定板在400或405nm 检测,通过样本和背景的吸光度比较来测定caspase3活性的增加，进而推知Caspases的活性。
原理：在Caspase的底物多肽(如Caspase-3的底物为DEVD)上标记pNA  (p-nitroanilide, 对硝
基苯胺).当活化的Caspase剪切标记的底物多肽后, pNA被释放出来,此时游离的pNA的发射光谱可用分光光度计或酶标仪在400或405nm 检测,进而推知Caspases的活性.
reaction视频怎么剪一．实验前准备：消毒的EP管、头、三蒸水、冰、水浴箱、实验组及对照组心肌组织、超速低温离心机、酶标仪、721分光光度计
二．活性测定操作步骤
（一）每组试剂组成
                      Samples（lysis buffer）  2×Reaction buffer  DEVD-PNA  总
Sample well  （标本组）      30ul                  65ul            5ul      100ul
Sample control（背景组）    30ul（lysis buffer）      70ul            0        100ul
            Sample well（样本组）           Sample control（背景组）
3小时组  N3  30ul样本                            30ul样本
            65ul Reaction buffer                70ul Reaction buffer
            5ul DEVD-PNA
        C3  30ul样本＋65ul Reaction buffer
5ul IETD-PNA                  30ul样本＋70ul Reaction buffer
        R3  30ul样＋65ul Reaction buffer
5ul LEHD-PNA                  30ul样本＋70ul Reaction buffer
6小时组 N6 30ul对照样本                    30ul样本
65ul Reaction buffer              70ul Reaction buffer
            5ul DEVD-PNA
C6  30ul样本＋65ul Reaction buffer
5ul IETD-PNA                    30ul样本＋70ul Reaction buffer
R6  30ul样本＋65ul Reaction buffer
5ul LEHD-PNA                  30ul样本＋70ul Reaction buffer
共需2×Reaction buffer810 ul，配制2×830ul以防不够，用前加入8.3ul DTT
活性表示为＝样本OD1－背景OD1（实验组）/样本OD2－背景OD2（对照组）
（二） ．操作步骤——酶标仪  1.取标记好的EP管（已消毒）2.取已冻好的冰块加点水，置插EP管的座于冰水中3. 放转子，打开高速离心机电源，时间、速度都在零位置
先开机将至4摄氏度
注意要配平套管A、B、C、D
注意：1.速度、时间均为0时，才能开电源
      2.设置温度降温  10min（夏天时间可以稍微长一些）
      3.开电源前先把转子放入
      4.定时－启动－慢慢调速 10000转（显示为1000转）
未配平－停机－重新配平－再开机
5.停机灯亮，开盖（复位：速度、时间均为0)
1． 从低温冰箱中取出用锡铂纸包着的组织（已称重标记好的），取2-3块（30mg/块），放在EP管中，一直浸在冰水中
2． 锡铂纸剥去，组织直接置于EP管中，加裂解buffer（溶后4摄氏度保存）约700ul
冰上EP管中，用小弯剪将心脏组织剪碎，越碎越好
组织、裂解buffer比例：1：10
冰上操作
3． 开匀浆机
取几块冰块于小烧杯中，接自来水成冰水液
将EP管置于盛有冰水的小烧杯中，固定于匀浆机上
先做对照组
将转头插于组织液面下，打开电源，逐渐调大速度至max，上下搅动，直至浑浊，基本无小的组织块为止
调小速度至零，关电源，取出转头，EP管放回冰水底座
用蒸馏水冲洗转头，液冲至废烧杯中
依次以同样方法将样本组进行匀浆
注意：放空转，慢慢加速，别转别上下移动轴
4． 匀浆后置于离心机内
先设时间10min        “起动”；缓慢增大离心速度至1000×10r/min；缓慢减小离心速度，降至30×10r/min时，“停机”灯亮，即可取出
注配平：套管A、B、C、D配平
5． 取Reaction buffer 6ml，用前加入60ul DTT（稀释100倍）
吸取上清至小EP管
依次加Reaction buffer、上清、底物至ELISA板，加底物时，每加一次换一个头（因为要混匀）
注：底物每取完一次都要盖盖，避光； 加完底物后，混匀。
Reaction buffer＋上清＋底物——Caspase3－DEVD-PNA
                            Caspase8－IETD-PNA
                            Caspase8－LEHD-PNA
6． 水浴箱中孵育90min
7． 预热酶标仪30min（提前半小时打开酶标仪）
8． 酶标仪上读取OD值（405nm处测）
三．测蛋白——721-100分光光度计
1.  需准备考马斯亮兰试剂盒（南京建成生物工程公司）
2．用剩余的血清测蛋白
3．样本管：每管2.1ml考马斯亮兰＋35ul血清  （考马斯亮兰原液5ul，5倍稀释）
  空白管：2.1ml考马斯亮兰
4．开盖调零，关盖调百，595nm处测定
注：提前计算所需Reaction buffer的量，然后用前加入DTT（稀释100倍）。
    注意：DEVD-pNA要避光保存。

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