谷氨酰胺转胺酶（TG酶）的催化机理及对鱼糜凝胶特性的影响
摘要：TGase由于可以催化蛋白质分子之间的交联，而被广泛应用于鱼糜凝胶的
改善和重组肉等食品中。本文总结了TGase的催化剂机理是催化酰基转移反应、交联反应、脱氨基化反应以及分解谷氨酸胺的反应。探讨TGase凝胶化温度、作用时间以及添加量对鱼糜凝胶特性和品质产生显著的影响，并对TGase的未发展方向提出展望。
关键词：谷氨酰胺转胺酶 转酰基反应  鱼糜凝胶 TGase添加量 TGase作用温度与时间
谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase，E.C.2.3.2.13)简称TGase，是一种具有改善蛋白质组织，风味及货架期等功能性质的生物酶。根据来源不同，一般把TGase分为组织谷氨酰胺转氨酶(TissueTransglutaminase，tTG)和微生物谷氨酰胺转氨酶(Microbial Transglutaminase，MTG)。1957年Clark等人[1]为了描述在豚鼠肝脏中观察到的转酰胺基作用，由此提出了转谷氨酰胺酶一词。早期的研究主要集中在动物组织中的谷氨酰胺转胺酶，而在1989年Audo等从轮枝酶链菌中分离得到TGase之后，TG酶在大规模发酵生产和食品工业的应用研究迅速发展起来[2]。
    TG酶一种球状单体蛋白、亲水性高、对热稳定，活性一般为22.6U/mg，等电点为8.9，分子量为38KDa，可以催化酰基转移反应。通过催化蛋白质分子内或分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间连接、以及蛋白质分子内谷氨酰胺酰胺基的水解，使蛋白质形成凝胶，改善蛋白制品的弹性、粘合性、保水性，并通过引入赖氨酸而提高了蛋白质的营养效价。大多数转谷氨酰胺酶需要Ca2+参与，但微生物TGase不需要Ca2+激活[2]。通过快速原子轰击质子技术及对多肽链片段的降解, 对微生物菌株中TGase 的结构进行分析, 发现该酶的一级结构由331个氨基酸残基组成，二级结构中α-螺旋占21%，β-折叠占31%[3]。三级结构为球状，其活性中心有一个半胱氨酸残基，若该残基被取代则酶失活。某些金属离子（Cu2+、Zn2+、Pb2+）和NEM（N-乙基-马来酰亚胺）可以抑制其活性[4]。而添加二硫苏糖醇（DTT）可打开蛋白中的二硫键使酶反应效率提高[5]。
1 TGase催化机理
转谷氨酰胺酶催化转酰基反应。酰基供体是蛋白质或多肽链上谷氨酰胺残基的γ-羟基酰胺基，受体可以为蛋白质肽链上赖氨酸残基的Ɛ-氨基、游离氨基酸的reaction biologyƐ-氨基、初级氨或水。TG酶在蛋白质内或蛋白质之间形成Ɛ-（γ-谷氨酸）赖氨酸的异型肽键，使蛋白质共价交联聚合。
但并不是所有包含Glu和Lys残基的蛋白质分子都可以发生交联，TG酶的催化作用具有一定的限制性[6]。TG酶催化蛋白质形成聚合物的交联程度与酶的来源以及底物蛋白质的构象有关。
TGase可以催化四种反应的进行：（1）酰基转移反应，该反应可以将甲硫氨酸或是赖氨酸这样的限制性氨基酸引入到蛋白质中，从而提高蛋白质的营养价值；（2）蛋白质的 Gln 残基和 Lys 残基之间的交联反应，该反应可以改变蛋白质的溶解性、起泡性、乳化性、流变性等多种性质，从而改变产品的质地与结构，使产品具有特有的质构与粘合性能；（3）脱氨基化反应，该反应能够改变蛋白质的等电点与溶解度，生成的谷氨酸还可以增加食品的风味；（4）分解谷氨酸胺生成谷氨酸和赖氨酸，而谷氨酸在食品鲜味上起着重要作用[7]。
2 TGase对鱼糜凝胶特性影响
  鱼糜凝胶特性的研究一般从四个影响因素下手，包括TGase添加量、TGase凝胶化温度、TGase作用时间以及pH。鱼糜凝胶特性好坏主要从破断强度、凹陷度和凝胶强度三个指标来反映，从分子水平上讲，TGase的添加催化了蛋白质分子之间形成交联键，而交联键的强度是氢键和疏水键的20倍[8]，使得凝胶内部的结合力增强，从而提高了凝胶的硬度和弹性。
2.1 TGase添加量对鱼糜凝胶特性影响
添加量对鱼糜凝胶特性产生显著的影响。很多研究者发现，随着TG酶添加量的增加，破断强度、凹陷度和凝胶强度三个值也在增加；但是TG酶添加到一定量后，破断强度、凹陷度和凝胶强度都会出现一定程度的降低。在陈海华等[9]人的研究中就会发现，TG酶添加量在80U/100g时凹陷度和凝胶强度达到最大值，添加量再增加凹陷度和凝胶强度反而会降低。适量的TGase添加量可以大大增强鱼糜凝胶强度，这是因为TGase的添加促进了肌球蛋白之间形成更多的交联键[9]，凝胶内部的结合力增大，从而使竹荚鱼鱼糜凝胶的破断强度、凹陷度、凝胶强度和持水力均显著增加。TGase添加量过多会导致破断强度、凹陷度和凝胶强度降低，一方面是由于蛋白质底物浓度没有变化，过量的TGase不能促进更多的的蛋白质分子进行交联。另一方面，通过Sakanoto研究发现[10]，蛋白质凝胶强度的降低是由于有过量谷氨酰胺或赖氨酸交联形成，从而破坏了热有道蛋白网络结构形成的均匀一致性。
2.2 TGase凝胶化温度对鱼糜凝胶特性影响
鱼糜凝胶的制作通常采用两段式加热的方式，因为两段式加热可以让蛋白质分子有一个充分
的伸展过程，保证蛋白质分子之间形成足够多的交联键，而一段式加热缩短了这个过程，不能使蛋白分子充分交联，不能质量较好的凝胶。许多学者研究表明,二段加热对提高许多鱼肌肉的凝胶特性有显著效果[11]。
凝胶化的过程中，凝胶特性也是随着温度的变化而发生显著变化。在很多研究中发现，形成鱼糜凝胶的温度在40℃左右，在该温度下，蛋白质分子受热后解离和伸展加剧,使得反应基团,特别是球蛋白的疏水性氨基酸残基暴露出来,这有利于蛋白质一蛋白质之间的相互作用,而TGase的添加,通过催化谷氨酞胺的酞基反应,促进了这种相互作用，促使凝胶能够形成致密、均匀的网络结构[12]；温度过低蛋白质分子不能充分伸展且酶活性较低，不利于凝胶的形成；而温度过高就会出现导致TGase活性下降，降低了TGase的催化作用；并且在50～70℃的较高温度下，TGase酶活性降低而鱼糜中的组织蛋白酶的活性增强 [13]，导致蛋白质的解链凝胶化，从而使蛋白质分子还没有来得及进行定向的排列，形成排列无序的粗糙的凝胶结构，导致鱼糜的凝胶特性降低。
2.3 TGase作用时间对鱼糜凝胶特性影响
两段式加热中，第一段加热是鱼糜凝胶化的主要过程。该加热过程，TGase处理时间长短对鱼糜凝胶特性产生显著影响。在时间的控制上跟添加量和温度是一样的，时间过长会导致鱼糜凝胶特性的降低。这一结论在孙静静的研究中得到证实[14]。如果不经过40℃的凝胶化过程，直接进行高温加热得到的鱼糜凝胶，其表面比较粗糙，有凝聚的蛋白颗粒。而在40℃左右的温度下，TGase作用一定时间会对鱼糜凝胶的凝胶特性产生良好影响。马静荣等人的研究中，南海鸢乌贼鱼糜在37.5℃下凝胶化3h的条件下形成高度致密、均一的三维网络[15]。这是因为一定时间的作用可以保证TGase对蛋白质底物的充分作用，使尽可能多的蛋白质形成交联键。但是随着作用时间的延长，凝胶特性三个指标均降低。可能的原因是由于所用TGase中含有少量的蛋白酶水解部分底物，导致交联的程度降低[16]。
2.4 TGase作用pH对鱼糜凝胶特性的影响
pH的改变不仅影响酶的稳定性,而且也与肌原纤维蛋白质整个体系有关。有研究表明，随着TGase 作用pH的升高，鱼糜的凝胶特性呈现上升趋势，在 pH6.5 时达到最大，随后呈现下降的趋势[17]。pH 的改变一方面与酶的稳定性有关，当TGase 处在极端的pH条件下易导致酶的失活，从而降低酶的催化能力。另一方面，蛋白质排斥的静电作用和吸引的疏水作用之
间的平衡会受到体系的影响，体系的改变破坏了作用力之间的平衡，导致凝胶的网络结构和凝胶性质受到影响[18]。鱼糜在凝胶化过程中，TGase 主要作用的蛋白为肌球蛋白，而肌球蛋白的等电点为pI5.4-5.6。当pH5.0时，蛋白质分子所带净电荷降低，占优势的作用力为吸引的疏水作用，导致肌球蛋白形成了结构相对紧密的凝结块，而非有序的网状结构，所作用的肽键很难与酶接触，因此在该条件下所形成的鱼糜凝胶其品质较差。
3 展望
通过谷氨酸胺转胺酶对蛋白质的作用,可以实现优势互补,提高蛋白质的营养价值,并改善蛋白质的理化性质。谷氨酞胺转胺酶对水产品主要有以下几个作用:(l)改善水产品中蛋白质的质构。(2)提高水产品营养价值。(3)提高水产品中凝胶的持水性。(4)形成薄膜用于水产品保藏和包装。
我国在水产品资源丰富,有着远大的应用潜力,随着发酵技术和基因技术的发展,谷氨酞胺转胺酶的产量会不断增长,成本会不断降低,谷氨酞胺转胺酶在水产品中的应用将不断扩大。
参考文献：
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[7]. 司晶星,张瑾,翟付谷氨酞胺转氨酶生产及研究进展.学术研讨,2009,6,227. 
[8]. Joseph.D, Lanier.T, Hamann.D, et al.Temperature and pH affect Transglutainase

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