基于网络药理学的脑震宁颗粒脑外伤的机制分析
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脑震宁颗粒是脑外伤、脑震荡的常用药品，由丹参、陈皮、当归、川芎、牡丹皮等11味药组成，具有活血凉血、化瘀通络、益血安神、宁心定智、除烦止呕等功效，可用于脑外伤引起的头疼、头晕、烦躁、失眠、健忘、惊悸、恶心、呕吐等。其中当归、川芎、丹皮、地龙等可养血活血、凉血通瘀，枣仁、地黄、茯苓等可宁心定智、益气安神，竹茹可和胃降逆，主、辅、佐共同发挥作用reactive是什么药[1]。
目前对脑震宁颗粒的药理药效研究较少，张明升等[2]研究了脑震宁的镇静和镇痛药效学作用，发现脑震宁能减少正常小鼠的自发活动次数，缩短钠所致小鼠睡眠的诱导期，显著延长小鼠睡眠时间，提高小鼠的痛阈和减少乙酸所致扭体反应。其他研究主要集中在脑震宁颗粒对脑外伤[1,3]、脑震荡[4]、颅内血肿[5]的临床疗效观察，证实其对重型颅脑损伤病人的头痛、头晕、失眠有良好的作用[5]。然而，对脑震宁颗粒脑外伤、脑震荡的作用机制目前尚未开展过相关研究。
融合系统生物学和多向药理学提出的网络药理学可构建药物-靶点-疾病之间的复杂网络，利用网络分析理论从整体角度研究药物作用机制，为中药多成分、多靶点的药物作用机制阐释提供了一种新的研究策略[6]。目前网络药理学已经用于远志[7]、六经头痛片[8]、大川芎方[9]
等多种中药或复方的作用机制研究。王昊等[7]用网络药理学的方法发现远志中的多种活性成分通过调控Aβ的生成与细胞的凋亡起到阿尔茨海默病的作用。董亚楠等[8]研究发现六经头痛片中18个化合物可通过72个作用靶标作用于88条通路，其作用机制与干预血管内稳态、炎症、神经中枢、免疫及激素调节等相关通路有关。本研究以脑震宁颗粒11味中药的主要成分为基础，运用网络药理学方法构建药材-成分-靶点-通路-疾病网络，系统预测其多成分、多靶点、多通路的作用特点，为进一步阐明其活性成分、作用机制以及发挥临床疗效的科学内涵提供依据。
1  材料与方法
1.1  活性成分的筛选及吸收、分布、代谢、排泄性质评估
通过查阅文献整理出脑震宁颗粒中每味药材的主要化学成分，同时利用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，P/LSP/tcmsp.php）对各成分的性质进行筛选，包括口服生物吸收利用度（OB）和类药性（DL）。利用PubChem数据库（/）下载各成分sdf格式的结构式，使用ChemDraw3D软件将其转为mol2格式文件保存。
1.2  靶点的预测
登陆DRAR-CPI（/drar）服务器上传筛选得到的脑震宁颗粒候选成分的mol2格式文件，下载计算结果。对接得分（Z-score）代表活性成分与蛋白质的相互作用强度，设定蛋白靶点
1.3  靶点类型归属
menu，Version 5.0）是一个包含与人类疾病相关的基因和变异的数据库。选择靶点检索后，依次输入脑震宁颗粒相关靶点，得到靶点类型的相关信息。
1.4  靶点间相互作用分析
String数据库（/）是一个搜寻蛋白间相互作用的数据库。既包括蛋白之间的直接物理作用，也包括间接功能相关性。选择Multiple Proteins检索，输入脑震宁颗粒相关靶点，设定物种为人，得到靶点之间的作用关系。
1.5  靶点生物学功能注释分析
将筛选得到的脑震宁颗粒作用靶点导入Cytoscape 3.5.1软件ClueGo插件，通过输入靶基因
名称列表并限定物种为人，经检索和转化操作，设定阈值P＜0.05，用CluePedia插件进行绘图，进行GO生物学过程富集分析。
1.6  靶点通路注释分析
将筛选得到的脑震宁颗粒作用靶点导入DAVID数据库，通过输入靶点名称列表并限定物种为人，并将所有靶点名称校正为其正式名称（official gene symbol），经上述数据库检索和转化操作，设定阈值P＜0.05，用GraphPad Prism 5绘图，进行KEGG代谢通路富集分析，并将脑震宁颗粒对应的靶点直接映射到通路上，药物靶点富集的通路被认为是药物调控的通路。对其中富集的疾病部分进行MeSH（/mesh/）分类分析。
1.7  药材-成分-靶点-通路-疾病网络构建
根据脑震宁颗粒潜在作用靶点的预测结果，采用Cytoscape 3.5.1软件的关联（Merge）功能构建脑震宁颗粒的药材-成分-靶点-通路-疾病网络模型。采用Network Analyzer功能对网络的度（degree）、中介度（betweenness centrality）、网络集中化（network centralization）和网络异质性（network heterogeneity）参数进行分析。网络中节点（node）
2  结果
2.1  脑震宁颗粒脑外伤活性成分的初步筛选
由于目前尚无脑震宁颗粒活性成分的研究报道，因此对脑震宁颗粒11味组方药材的主要化学成分进行文献检索，并通过TCMSP数据库对这些成分的ADME性质进行分析，以OB≥30%和DL≥0.18为指标[10]进一步筛选。虽然部分成分（如阿魏酸、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯A等）OB值和DL值较低，或无OB、DL值报道（羽扇豆烯醇、羽扇豆烯酮等），但是这些成分在药材中含量较高，或研究显示其具有明显的药理作用，因此将这些成分也纳入后续的网络药理学分析，共得到10味药材的代表性化学成分33个（表1）。
2.2  脑震宁颗粒活性成分靶点的预测、类型归属及靶点之间作用分析
将脑震宁颗粒的33个代表性化学成分输入DRAR-CPI后返回各成分所对应靶点的chemical-pr
otein打分值，以Z-score＜−1为阈值筛选后共得到349个靶点。在Uniprot网站输入这些靶点的PDB ID，共对应得到301个靶点。运用CooLGeN和Gene Card数据库搜索文献报道中与脑外伤（cerebral trauma）、脑震荡（brain concussion）、神经保护（neuroprotection、neuroprotective）、神经再生（nerve regeneration）相关的靶点，并与上述301个靶点进行对比分析，得到34个可能与脑震宁颗粒脑震荡、脑外伤相关的潜在作用靶点（表2）。其中茯苓新酸A拥有最多的潜在靶点（10个），其次是茯苓酸B（9个）、藁本内酯（8个）、丹参酮I（7个）、槲皮素（6个）、α-雪松醇（6个）、没食子酸（6个）、丹皮酚（5个）、阿魏酸（5个）、洋川芎内酯A（4个），这些拥有较多靶点的成分对于脑震宁颗粒脑外伤可能发挥关键作用。此外，1个靶点也可能对应脑震宁颗粒的多种化学成分，如靶点MAPK1对应的成分数量最多（15个），其次是IL10（10个）、CASP3（10个）、IL4（8个）、F9（8个）、GSK3B（7个）、HGF（6个）。

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