目录
摘要 .................................................................................................................................. I Abstract ........................................................................................................................... III 第1章文献综述.. (1)
1.1氧化胁迫概述 (1)
1.2活性氧自由基的分类 (1)
1.3 ROS的主要来源 (2)
1.4氧自由基的危害方式 (2)
1.5氧化胁迫的引发因素 (3)
1.6氧化胁迫与疾病 (4)
1.7氧化胁迫的控制与干预 (5)
1.8天然植物性抗氧化剂的开发利用 (6)
1.9黄连在氧化应激方面的研究 (7)
1.10氧化胁迫造模方法研究现状 (8)
1.11本课题研究的可行性论证 (9)
第2章引言 (11)
2.1 研究目的和意义 (11)
2.2 研究内容 (11)
第3章斑马鱼氧化胁迫模型的建立 (13)
3.1 前言 (13)
3.2实验材料和仪器 (13)
3.3方法 (14)
3.4统计分析 (15)
3.5  实验结果 (15)
3.6小结与讨论 (18)
第4章药根碱对LPS诱导的斑马鱼胚胎体内抗氧化作用 (19)
4.0前言 (19)
4.1 实验材料和仪器 (19)
reactive是什么药
4.2 实验方法 (19)
4.3 数据分析 (21)
4.4 实验结果 (21)
4.5 小结与讨论 (25)
第5章药根碱斑马鱼成鱼抗氧化活性研究 (27)
5.2实验材料和仪器 (27)
5.3 实验方法 (28)
5.4 统计分析 (29)
5.5 实验结果 (29)
5.6 小结与讨论 (30)
第6章药根碱对HepG2细胞的抗氧化应激作用机制研究 (33)
6.1 实验材料和仪器 (33)
6.2 实验方法 (34)
6.4实验结果 (38)
6.5 小结与讨论 (40)
结论与展望 (41)
参考文献 (43)
中英文缩略名词对照表 (49)
致谢 (51)
摘要
斑马鱼氧化应激模型优化及药根碱抗LPS 介导的氧化应激机制研究
专业生物化学与分子生物学学
硕士研究生韩玉龙
指导老师叶小利教授
摘要
氧化应激是指机体在遭受各种刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）过量产生，超出机体的清除能力，致氧化和抗氧化状态失去平衡，进而引起组织氧化损伤。氧化应激产生的过量自由基，可直接或间接损伤DNA、使蛋白质氧化，结构和功能缺陷而丧失生物活性、生物膜的脂质过氧化，是引起衰老、神经退行性疾病、癌症、糖尿病、高血压、阿尔茨海默病、帕金森症、癌神经变性、外伤性远隔脏器损伤、肾小管上皮损伤等各种疾病的发生的重要因素之一。因此研究氧化应激具有很重要的临床应用价值。建立可靠的氧化应激模型, 对于揭示氧化应激机制以及研究和筛
选抗氧化药物和功能食品都有重要意义。鉴于目前学术上尚无通用的氧化应激造模方法，本文以斑马鱼为模型动物，通过比较醋酸铅、AAPH、脂多糖三种不同的诱导剂对斑马鱼胚胎进行氧化胁迫的造模，以期建立一种简便、灵敏、快速、直观地检测氧化胁迫的斑马鱼模型和方法。黄连具有抗菌、抗病毒、抗炎症、降血糖、降血脂等功效，药根碱（JAT）是黄连中主要的活性物质之一，并且安全性相对较高。本文前期研究表明药根碱具有抗氧化活性。现在，黄连抗氧化应激被认为是一种新的方案，它具有抗氧化活性高、用量少、副作用低等优势。因此本实验研究，探索药根碱对斑马鱼成鱼的抗氧化活性和机制的研究。
本实验研究的主要内容和结果：
（1）实验分为对照组、脂多糖组、醋酸铅组合AAPH组，每组挑选受精后6h健康的斑马鱼胚胎，首先对各模型组给药，脂多糖(1ppm)、醋酸铅(1.6·10-6ppm)、AAPH （12.5ppm），检测不同诱导剂对胚胎成活率的影响。结果表明，对照组的孵化率为92%，脂多糖组为85.3%，醋酸铅组82.7%，AAPH组为66.8%。
（2）通过对诱导后的斑马鱼胚胎进行DCFH-DA探针的处理，以检测不同造模剂对氧化应激的关键指标ROS生成的影响。结果表明，AAPH组的荧光强度为NC组的1.79倍，而LPS组和(CH3COO)2Pb组为正常组的1.97和2.11倍。
（3）通过对胚胎进行DPPP探针处理，以检测不同造模剂造成的脂质过氧化程度的差异。
机体受胁迫后产生的氧自由基，能攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作
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用，并因此形成脂质过氧化物，进而引起细胞损伤。结果表明，AAPH组与NC组相差不大，LPS组和(CH3COO)2Pb组的荧光强度分别为NC组的2.19倍和1.93倍。（4）通过对胚胎进行AO探针处理，以检测不同造模剂对细胞死亡率的影响。机体发生氧化胁迫后，发生氧化损伤，从而对细胞中的DNA造成伤害。AO探针与DNA结合发出绿荧光，与RNA结合量多发出红荧光。与NC组相比，LPS组和(CH3COO)2Pb 组的荧光强度分别为其2.17倍和2.65倍，AAPH组略微高于NC组。
（5）药根碱对LPS诱导的斑马鱼胚胎体内抗氧化实验，分为NC组、LPS组、药根碱低、中、高组，在三个探针检测的指标上，药根碱均显示出清楚自由基而达到对机体的保护作用。而且在ROS指标上还存在剂量依赖关系。
（6）斑马鱼成鱼分为药根碱组、对照组，模型组，模型组按饲料量的0.05%脂多糖喂食，药物组分别喂食0.1%、0.2%、0.5%的药根碱。20d后，取斑马鱼的血清和肝脏。
分别检测血清和肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛(MDA)和还原性谷胱甘肽(CAT)的活性和含量。在上面三个指标上，药根碱均显示出了良好的抗氧化能力，具有较好的开发应用前景。
（7）初步探究药根碱对脂多糖诱导的HepG2细胞中氧化靶点的影响。利用Western blot检测HepG2细胞中参与氧化调节的关键基因JNK、ERK1/2、NF-κB、MAPK、AKT等的表达。结果表明，药根碱通过抑制JNK通路的活化，从而降低氧化通路上相关蛋白JNK、ERK的磷酸化作用，以发挥其抗氧化功效。
关键词：氧化应激，斑马鱼模型，药根碱，机制
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