1.4肿瘤微环境响应型纳⽶药物载体
肿瘤微环境响应型纳⽶药物载体
1 肿瘤微环境概述
如图7所⽰实体肿瘤中包含多种间质细胞包括肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts, CAFs）、肿瘤内⽪细胞、肿瘤细胞、免疫细胞（T 细胞，巨噬细胞，树突细胞和B细胞）、髓源抑制性细胞、细胞基质细胞和⼀些其他细胞等相互作⽤形成等。具有⾎液供应不充⾜、营养成分缺乏、细胞间质⾼压等特点。各种细胞类型都有其特殊的功能。这些细胞⽣长于包括胶原蛋⽩和蛋⽩聚糖在内的细胞外间质中。这些间质成分为肿瘤细胞的⽣长提供了很好的⽔合基质环境。
CAFs是肿瘤基质的主要成分，发挥着分泌基质蛋⽩、⽣长因⼦、细胞因⼦和激素的作⽤。与正常组织中的成纤维细胞相
⽐，CAFs细胞是更⼤的纺锤形间质细胞，能够促进肿瘤的发⽣、进展和转移。CAFs细胞与肿瘤细胞相互促进异型性进展。肿瘤细胞能够分泌⼀些⽣长因⼦影响CAFs，包括转化⽣长因⼦（transforming growth factor-β1, TGF-β）和⾎⼩板来源⽣长因⼦（platelet derived growth factor, PDGF）。另⼀⽅⾯，CAFs 能够分泌纤维细胞⽣长因⼦（fibroblast growth factor, FGF），基质细胞衍⽣因⼦1 （stromal cell-derived fa
ctor 1, SDF1），基质蛋⽩酶（matrix metalloproteinases,MMPs）和胰岛素样⽣长因⼦（IGF1），从⽽进⼀步的促进肿瘤⽣长、⾎管⽣成和肿瘤转移。除此之外免疫细胞是另⼀⼈类肿瘤中⾮常重要的细胞，能够分泌炎性因⼦调控肿瘤微环境。肿瘤浸润的淋巴细胞包括T细胞、B细胞和NK细胞发挥免疫应答的作⽤。
图 7 肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的主要细胞和细胞间质成分⽰意图。
Paget提出“种⼦与⼟壤”的假说：将肿瘤细胞⽐喻为“种⼦”，肿瘤微环境⽐喻为“⼟壤”，种⼦的⽣长必须
从周围的⼟壤获取营养成分，形象地揭⽰了肿瘤细胞⽣长对肿瘤微环境的依耐性。深⼊了解肿瘤微环境特点和肿瘤微环境与肿瘤细胞的相互作⽤关系，可以为抗肿瘤药物的研发提供⼀定的理论基础。
在癌症的过程中，以肿瘤微环境为靶点来设计抗癌新疗法是迫切需要的。研究者基于肿瘤微环境与正常组织之间的显著差异包括⾎管密度低、乏氧、弱酸性、还原性、酶过表达等特点来制定不同的研究策略。其中肿瘤局部⾎管的形成与肿瘤微环境也息息相关，⾎管可提供肿瘤有氧呼吸所需的氧⽓，对肿瘤的恶性增值具有重要作⽤。肿瘤组织新陈代谢所必需的氧⽓和营养都有肿瘤⾎管提供，促进肿瘤细胞迅速的⽣长并同时向远端转移。随着研究者们对肿癌的深⼊研究，发现单纯靠杀死肿瘤细胞是不能够完全治愈癌症的，特别是在过程中反复多次的给药引起的肿瘤耐药性，⽽肿瘤的转移和复发是导致愈后效果差和最终引起患者死亡的重要因素，研究发现肿瘤的多药耐药和转移与肿瘤微环境中基质细胞的损伤有关。
肿瘤微环境和肿瘤细胞内信号可以激活纳⽶载药体系，将输送的基因和药物释放到肿瘤部位。癌症相关的刺激响应纳⽶系统已经越来越多地考虑⽤于递送抗癌药物，其主要靶向肿瘤微环境和/或细胞内信号以增强肿瘤内积聚并促进靶位点的药物释放。促进药物输送和释放的信号主要包括肿瘤和内吞酸性（pH），缺氧（Hypoxia），酶（Enzyme）过表达和⾼⽔平的细胞内⾕胱⽢肽（GSH），活性氧（ROS）和三磷酸腺苷（ATP）。因此，研发响应肿瘤微环境和肿瘤细胞内信号的纳⽶药物递送系统（DDS）是迫切需要的。如下⽰意图形象说明了肿瘤微环境和细胞内信号在肿瘤靶向和静脉给药后控制
药物释放的作⽤过程。
图1 肿瘤微环境和细胞内信号在肿瘤靶向和静脉给药后药物释放的作⽤⽰意图。纳⽶载体
在响应肿瘤细胞外信号，包括低pH，过度表达的癌症相关酶和缺氧之后可以被激活，增强肿瘤中的积聚和细胞摄取。抗癌药物可响应细胞内信号⽽选择性释放，包括低pH值，氧化
还原电位，酶，ROS，缺氧和ATP
2 肿瘤微环境响应型纳⽶载药系统
研究发现肿瘤微环境是⼀个缺氧、弱酸性并有多种不同免疫细胞组成的复杂微环境，对肿瘤的发⽣、恶性增殖及转移有极其重要的调控作⽤。因此，设计针对不同细胞和靶点的新型药物载体来抑制肿瘤已经是⼀种新的策略。常⽤的肿瘤微环境刺激因⼦有活性氧（reactive oxygen species，ROS）、还原性物质、pH、酶、乏氧、三磷酸腺苷（ATP）等。肿瘤细胞内微环境也有着特异性，例如线粒体内⾼⽔平的氧化性H2O2，细胞质和内涵体/溶内存酶体内⾼浓度的⾕胱⽢肽（GSH），溶酶体和内涵体内的pH偏酸性（pH 4.5-6.5）等。利⽤肿瘤微环境的特点来达到靶向的⼴谱、低毒、耐药性⼩的⽬的，有效地切断肿瘤微环境与肿瘤细胞之间的相互作⽤，有效地抑制肿瘤细胞的⽣长。因此，可针对肿瘤微环境特殊的⽣理特性设计能够有效的响应这些刺激，靶向输送和释放基因/药物的纳⽶载药体系。
在⽣物材料研究领域，许多科研⼯作者致⼒于研究⽣物响应性的纳⽶材料。这些材料的最⼤优势是能够有效地识别肿瘤局部⽣理条件的异常。肿瘤细胞微环境响应的纳⽶载药体系携带基因和药物之后需要满⾜在⽣理条件下稳定但是在肿瘤微环境靶向传递并且迅速释放，以提⾼肿瘤部位的药物富集量，减少药物在⾎液循环过程中损失，提⾼⽣物利⽤度，减少毒副作⽤，实现药物的有效释放。根据刺激因素的不同，可将刺激响应性纳⽶载体分为ROS 响应，氧化还原响应，pH响应（酸），体内⽣物酶响应，乏氧响应、ATP响应，热响应以及其他响应。
刺激响应型药物传递系统作为⼀种智能型载体系统，可对不同类型的刺激作出反应，从⽽将荷载的药物在特定的时间和空间进⾏控制性释放（如图1-2所⽰）。刺激响应型药物传递系统为实现⾼效的、精准的
、多通路的肿瘤联合创造了条件。根据引发响应的刺激信号来源不同，可分为内源刺激（Intrinsic stimuli）响应型药物传递系统和外源刺激（Extrinsic stimuli）响应型药物传递系统。内源性刺激信号来源于肿瘤病理环境的变化，主要有低pH值、⾼还原电势、酶浓度、体温过热等；外源性刺激信号主要有特定波长的激光、磁场、电场和超声波等。
图1-2 刺激响应型药物传递系统药物控释
2.1 内源刺激响应型药物传递系统
内源刺激响应型药物传递系统在正常组织和⾎液中能保持载体与药物结构稳定，减轻药物对正常组织的损害。肿瘤微环境和正常组织之间pH值、⾕胱⽢肽（Glutathione, GSH）浓度、基质酶、温度等均存在差异，这些差异使得刺激响应型药物传递载体容易在肿瘤组织富集并特异性释放荷载药物，增强癌症效果。
2.1.1 pH响应型纳⽶药物载体
由于在癌症组织中的pH与正常组织相⽐具有较⼤的差异，因此pH响应性纳⽶载体得到了⼴泛的研究。肿瘤细胞与正常细胞之间pH值存在差异的主要原因是肿瘤细胞⽆限增殖，⽽肿瘤微弱的脉管系统不能提供⾜够的氧⽓和营养物质来满⾜肿瘤细胞的有氧呼吸，因此肿瘤组织经常在缺氧或⽆氧条件下进⾏⽆氧呼吸，⽆氧呼吸过程中会产⽣⼤量的乳酸，致使肿瘤组织转变为弱酸性。正常组织的接近中性pH（7.4），⽽⼤多数肿瘤细胞内的pH（≤6.5），利⽤肿瘤细胞内微弱的酸性来控制药物和基因输送与释放是响应性纳⽶载体的研究范围之⼀。含有⼄缩醛、腙、肟、酰肼、氨基甲酸酯及酯类等化学结构的位置对pH敏感，可设计含有这些结构的载体材料。⽬前设计肿瘤微环境酸响应型的载体主要有以下两种⽅法：⼀种是利⽤⼀些不稳定化学键来制备载体，其在⽣理条件下稳定，但是在肿瘤的微酸环境下，化学键可发⽣断裂，使药物得到释放，提⾼药物摄取率。另⼀种是利⽤含有质⼦的基团的物质来合成载体。在不同酸性条件下这些化学功能键发⽣⽔解，使纳⽶载体在pH相对较低的肿
瘤微环境下发⽣断裂，从⽽有效靶向释放被载物，达到输送药物与靶向效果。
表 1-1 ⽤于联合的pH响应型药物传递系统
纳⽶载体载体材料传递药物两亲性线性-树枝状⾼
分⼦甲氧基聚⼄⼆醇-b-聚酰胺-胺嵌段聚合物
DOX
羟基喜树碱（HCPT）
空⼼介孔⼆氧化硅
（HMSNP）叶酸-聚⼄烯亚胺包裹的HMSNPs
DOX
siRNA
阳离⼦胶束纳⽶颗粒双重pH响应的PDMA-b-PDPA嵌段聚合物
Bcl-2 siRNA，
紫杉醇（PTX）聚合物胶束SMA-⼄⼆酰肼通过腙键与DOX连接
DOX
双硫仑（DSF）前药纳⽶粒⼦羧基修饰的聚乳酸顺铂前药修饰的-D-TPGS
顺铂
多烯紫杉醇
聚离⼦复合物胶束
PEI-PEG共聚物，磺胺甲基嘧啶
(SA)-PEG-NGR DOX DNA
聚⼆异丙基⼄醇胺；SMA：聚苯⼄烯-顺丁⼆酸苷；TPGS：d-α-⽣育酚聚⼄⼆醇1000琥珀酸酯。
利⽤肿瘤组织的微弱酸性这个特点，可将药物稳定运送到特定部位，可以将在⾎液循环过程中处于“沉默
”状态的药物富集到肿瘤部位，在肿瘤微酸环境弱酸性条件下化学键断裂或使电荷解离，暴露出“激活”状态的药物，增强肿瘤细胞对药物的摄取，从⽽提⾼抗肿瘤效果并且降低毒性。
Wang课题组设计了⼀种具有肿瘤微环境pH敏感性的去PEG化能⼒的三元复合物递送siRNA。阳离⼦复合物ssPEI800/siRNA 通过静电吸附表⾯包被了⼀层具有肿瘤pH敏感性聚⼄⼆醇化阴离⼦聚合物（PPC-DA）。在肿瘤细胞外温和的酸性条件下，中性条件下稳定存在的酰胺键快速⽔解暴露聚⼄醇化的阳离⼦氨基PCC，因此PCC在静电排斥的作⽤下与带有⾼正电荷的阳离⼦复合物ssPEI800/siRNA 解离，这就促进了siRNA的内吞并且增强了抗肿瘤活性，（如图2.3a）。
电荷翻转也是肿瘤靶向输送的有效⽅法，在响应环境中酸度的变化后其表⾯电荷从增强循环的阴性逆转为阳性以增加细胞摄取或细胞内药物输送。对于对细胞外或细胞内肿瘤响应的药物递送系统，在中性条件下表⾯是负电荷，在肿瘤或者溶酶体酸性条件下转变为正电荷。
Mo等⼈研发了⼀种线粒体靶向的脂质体(HHG2C18-L)能够循序地响应肿瘤微环境和细胞内不同部分的pH，表⾯的脂质层是⼀种合成的多功能的脂质体，包含1,5-双⼗⼋烷基-L-⾕氨酰2-组氨酰六氢苯甲酸（HHG2C18）。⽣理pH条件下HHG2C18-L表⾯的负电荷能够在肿瘤pH 条件下转换成正电荷，促进细胞内吞。在胞吞⼊内涵体后，组氨酸组对内涵体逃逸发挥质⼦缓冲作⽤，⽽羧酸基团因降解⽽脱落六氢苯甲酰胺。逃逸进⼊细胞质后，随着羧酸基团的去除，脂质体具有更⾼的正电荷，优先积累在脂质体上
静电吸附驱动的线粒体。HHG2C18-L表现出相当⾼的抗癌性功效，加⼊合成的聚⼄⼆醇化脂质确保脂质体在⾎液中的持久性增加对肿瘤⽣长的抑制作⽤，（如图2.3b）。
图2.3 pH响应型的肿瘤靶向。（a）具有肿瘤pH敏感性的去PEG化能⼒的三元复合物递送siRNA。（b）对肿瘤细胞外和细胞内酸度有响应的两性离⼦寡肽脂质体靶向线粒体输送药物。
2.1.2 酶响应型纳⽶药物载体
酶在⼤多数代谢过程中作为⼤分⼦⽣物催化剂发挥重要作⽤。包括癌症在内的许多疾病的病理学与酶的功能障碍或其表达的失调有关。已有多种酶响应性纳⽶载药体系⽤于抗癌药物输送，其通过掺⼊可被肿瘤细胞外或细胞内环境过表达的酶识别和降解的特异性部分。与癌相关的酶包括基质⾦属蛋⽩酶（MMP）
，透明质酸酶（HAase）和组织蛋⽩酶（Bcathepsin B）。
reactive是什么药杂化纳⽶粒⼦PEI-PEG通过可被MMP-2酶降解的多肽⽚
段连接到氧化⽯墨烯上
DOX
DNA
聚合物胶束树突装硫醇盐超⽀化聚⽢油DOX前药
甲氨蝶呤前药
树枝状⼤分⼦MMP-2酶敏感的PEG-pp-PEI-PE共聚物PTX siRNA
肿瘤组织中的酶浓度和活性均显著⾼于正常组织，这些酶对肿瘤的⽣长、增殖及转移都
有重要影响。酶具有⾼度的选择性，⽤特异性酶作为肿瘤的靶点，是纳⽶载体研究的⼀个新的⽅向。⾦属蛋⽩酶（MMP）是⼀类在细胞基质中分解细胞组分的蛋⽩酶，其在肿瘤细胞中过度表达，对癌细胞的转移有重要影响。特别是MMP-2和MMP-9，在⼤部分肿瘤组织如胃癌、结肠癌、直肠癌、前列腺
癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌中都过度表达。
图2.4-1 ⾦属蛋⽩酶2响应的多功能脂质体纳⽶载体输送药物⽰意图除此之外，还有⼀些其他的酶（如糖苷酶、酯酶、组织蛋⽩酶）等也被设计应⽤于构建酶敏感的纳⽶载体。如在PEG链上接⼊对酶敏感的多肽，在酶解作⽤下脱去 PEG 外壳，暴露内部药物核⼼。Torchilin等⼈设计以⼀种多功能的脂质体包含TAT-PEG2000和抗体连接的PEG3400-PE，PEG3400和PE之间通过⾦属蛋⽩酶裂解的短肽连接，（如
图2.4-1）。在肿瘤的化疗和基因联合⽅⾯，Jiang等⼈研制了⼀种肿瘤微环境pH和MMP 双响应的功能化的纳⽶粒⼦ dtACPP，（如图2.4-2）。在纳⽶载体dtACPP中，细胞膜穿透肽（CPP）的细胞穿透活性受到pH 敏感的掩蔽肽的限制，该掩蔽肽通过MMP可⽔解并与CPP共价结合。掩蔽肽在中性pH下显⽰负电荷通过静电相互作⽤有效地屏蔽CPP，在肿瘤低pH值下被中和以消除屏蔽效应。在MMP作⽤下，dtACPP被激活为CPP增加细胞内基因和药物的积累。
图2.4-2 酶响应的药物释放和肿瘤靶向。通过pH和MMP双活化的功能化的 CPP（dtACPP）肿瘤微环境
响应纳⽶颗粒⽤于联合化疗和基因
2.1.3 氧化还原响应型纳⽶药物载体
肿瘤组织代谢异常，导致肿瘤组织中存在较强的还原环境。肿瘤细胞内除了有还原性物质⾕胱⽢肽（GSH），还有少量的⼆价铁离⼦（Fe2+）、半胱氨酸（Cys）、硫氧还原蛋⽩还原酶和溶酶体硫醇还原酶等还原性物质。GSH是⼀种⾕氨酰基半胱氨酰⽢氨酸三肽，能帮助保持机体正常的免疫系统功能，并具有抗氧化作⽤和整合解毒作⽤，半胱氨酸上的巯基为其活性基团，是哺乳动物细胞中含量最丰富的硫醇类化合物。肿瘤细胞内的GSH浓度（2-10 mmol/L）是细胞外浓度（2-20µmol/L）1000倍以上，肿瘤细胞与正常细胞之间的浓度差异较⼤，尤其是在⼀些耐药肿瘤细胞中，浓度差可⾼达10倍。因此，这种肿瘤细胞内外还原性⾕胱⽢肽量的差异，设计还原响应型纳⽶药物载体实现肿瘤细胞内还原响应性释药提供了⼀种新的可能性。
表 1-2 ⽤于联合的氧化还原响应型药物传递系统纳⽶载体载体材料传递药物
杂化胶束可⽣物降解的聚合物甲氧基聚⼄⼆醇-b-聚

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