一种类风湿关节炎并间质性肺疾病大鼠模型的
构建及评估*
欧慧萍1，2
， 吴趋荟1， 袁
多2， 柳玉佳3， 林辉2， 李鑫1△， 范伏元3△
（1湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012；
3
湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）
［摘要］ 目的：构建一种模拟人类类风湿关节炎（rheumatoid arthritis ， RA ）并间质性肺疾病（RA -associated
interstitial lung disease ， RA -ILD ）病理特征的RA -ILD 大鼠模型。方法：将24只SD 大鼠随机分为3组，分别为对照组、RA 组和RA -ILD 组，每组各8只。行胶原诱导性关节炎（collagen -induced arthritis ， CIA ）造模，RA -ILD 组同时采
reactive是什么药
用气管内滴入博来霉素（bleomycin ， BLM ）行肺纤维化造模。观测大鼠体质量并进行关节炎评分；ELISA 检测血清类风湿因子（rheumatoid factor ， RF ）、抗环瓜氨酸肽抗体（anti -cyclic citrullinate peptide antibody ， Anti -CCP -Ab ）、C 反
应蛋白（C -reactive protein ， CRP ）、基质金属蛋白酶7（matrix metalloproteinase -7， MMP -7）、转化生长因子β1（trans‑forming growth factor -β1， TGF -β1）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor -α， TNF -α）含量；HE 及Masson 染观察滑膜和肺组织病理学形态改变，依据染结果评判大鼠RA -ILD 发病率；免疫组化和Western blot 方法检测肺组织
MMP -7和白细胞介素22（interleukin -22， IL -22）表达水平。结果：（1）与对照组比，造模第0、7、14、21和28天，RA 组和RA -ILD 组大鼠体质量无显著差异，第35天时RA 组和RA -ILD 组大鼠体质量显著降低（P <0.05）；（2）与对照组相比，第7、14、21、28和35天时RA 组和RA -ILD 组关节炎评分均显著升高（P <0.05）。（3）ELISA 结果显示，构建RA -ILD 4周（37 d ）后，RA 组和RA -ILD 组血清RF 、Anti -CCP -Ab 、TNF -α、MMP -7、TGF -β1及CRP 含量均较对照组显著升高（P <0.05）；RA -
ILD 组血清Anti -CCP -Ab 和TNF -α含量较RA 组显著升高（P <0.05）。（4）构建RA -ILD 模型4周后，HE 染发现RA 组和RA -ILD 组滑膜均出现明显的增生及炎症浸润现象；肺部皆可见明显肺泡结构紊乱，肺泡间隔增宽，肺泡壁增厚，大量炎性细胞渗出。构建RA -ILD 模型4周后，Masson 染观察到明显的蓝胶原纤维沉积及纤维灶形。（5）构建RA -ILD 模型4周后，与对照组相比，RA 组和RA -ILD 组大鼠RA -ILD 发病率显著升高（P <0.05）；与RA 组相比，RA -ILD 组RA -ILD 发病率显著升高（P <0.05）。（6）免疫组化和Western blot 结果显示，构建RA -ILD 模型4周后，与对照组相比，RA 组和RA -ILD 组肺组织MMP -7和IL -22表达显著上调。结论：SD 大鼠经CIA 联合BLM 诱导建立的RA -ILD 模型可作为研究RA -ILD 发病机制的一种实验动物模型。
［关键词］ 类风湿关节炎；间质性肺疾病；胶原诱导性关节炎；博来霉素
［中图分类号］ R593.22； R563.1+3； R363  ［文献标志码］ A doi ： 10.3969/j.issn.1000-4718.2023.06.023Evaluation of methods for establishing a mouse model of rheumatoid ar⁃thritis -associated interstitial lung disease
OU Huiping 1，2
， WU Quhui 1， Yuan Duo 2， LIU Yujia 3， LIN Hui 2， LI Xin 1△， FAN Fuyuan 3△
（1Hunan University of Chinese Medicine ， Changsha 410208， China ； 2Hunan Traditional Chinese Medicine College ， Zhu⁃zhou 412012， China ； 3The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine ， Changsha 410007， China. E -mail ： ffy 023@163 ； lixin 20082005@163 ）
［ABSTRACT ］ AIM ： To establish a rat model of rheumatoid arthritis （RA ）-associated interstitial lung disease （RA -ILD ） that mimics the pathological features of human RA with interstitial pneumonia. METHODS ： Twenty -four SD rats were randomly divided into 3 groups ： control group ， RA group and RA -ILD group. The collagen -induced arthritis
（CIA ） model was established in RA group and RA -ILD group. The mice in RA -ILD group were treated with bleomycin ［文章编号］ 1000-4718（2023）06-1145-08
［收稿日期］ 2022-09-19  ［修回日期］ 2022-12-15
* ［基金项目］ 国家自然科学基金项目（No. 81803993）；湖南省自然科学基金项目（No. 2020JJ5434）；湖南省教育厅科学研究项目（No. 19C1446）；湖南省中医药科研计划项目（No. 2021038）；湖南中医药高等专科学校校级科研项目（No. XY2022.006）△通讯作者 范伏元 Tel ： 0731-********； E -mai1： ffy023@163 ； 李鑫 Tel ：188****3325； E -mail ： lixin20082005@16
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（BLM） intratracheal instillation for modeling of pulmonary fibrosis. The body weight and arthritis scores of the rats were observed. Serum levels of rheumatoid factor （RF）， anti-cyclic citrullinate peptide antibody （Anti-CCP-Ab）， C-reactive protein （CRP）， matrix metalloproteinase-7 （MMP-7）， transforming growth factor-β1 （TGF-β1） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were measured by ELISA. Histopathological changes of the synovium and lung were observed by HE and Mas‑son staining. The incidence of RA-ILD in the rats was evaluated according to the results of HE and Masson staining. The protein expression levels of MMP-7 and interleukin-22 （IL-22） in lung tissues were measured by immunohistochemistry and Western blot.RESULTS：（1） Compared with control group， there was no significant difference in body weight be‑tween RA group and RA-ILD group on day 0， day 7， day 14， day 21 and day 28， while the body weight of the rats in RA group and RA-ILD group on day 35 was lower than that in control group （P<0.05）.（2）Compared with control group， the arthritis scores of the rats in RA group and RA-ILD group on day 7， day 14， day
21， day 28 and day 35 were significantly increased （P<0.05）.（3） ELISA results showed that the serum levels of RF， Anti-CCP-Ab， TNF-α， MMP-7， TGF-β1 and CRP in RA and RA-ILD groups were significantly increased compared with control group （P<0.05）， and the serum levels of Anti-CCP-Ab and TNF-α in RA-ILD group were significantly higher than those in RA group on day 37 after the construction of RA-ILD for 4 weeks （P<0.05）.（4） HE staining showed that the synovium of the rats in RA group and RA-ILD group showed obvious synovial hyperplasia and inflammatory infiltration on day 37. The rat lungs in RA group and RA-ILD group showed obvious alveolar structural disorder， widened alveolar septum， thickened alveolar wall， and mas‑sive inflammatory cell exudation. On day 37， Masson staining showed obvious blue collagen fiber deposition and fiber foci in lungs of RA group and RA-ILD group.（5） On day 37， the incidence of RA-ILD in RA and RA-ILD groups was higher than that in control group （P<0.05）， and that in RA-ILD group was higher than that in RA group （P<0.05）.（6） Immu‑nohistochemistry and Western blot results showed that the expression levels of MMP-7 and IL-22 in lung tissues of the rats in RA group and RA-ILD group on day 37 were significantly up-regulated compared with control group.CONCLUSION：The RA-ILD model of SD rats induced by CIA combined with BLM can be used as an experimental animal model to study the pathogenesis of RA-ILD.
［KEY WORDS］rheumatoid arthritis； interstitial lung disease； collagen-induced arthritis； bleomycin
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis， RA）是以慢性关节炎为主要病理特征的自身免疫病，主要累及关节周围，表现为慢性、对称性、多发性关节疼痛肿胀，且缠绵不愈［1- 2］。关节炎是RA最常见的表现，但
RA也常累及关节外的组织器官，间质性肺疾病（in‑terstitial lung disease， ILD）是RA最常见的关节外并发症。目前RA合并ILD（RA-associated ILD，RA-ILD）的具体发病机理尚未完全阐明，而建立理想动物模型是实验研究的基础。
RA-ILD的实验模型主要有四种。（1）SKG小鼠模型：Keith等［3］报道SKG模型能自发表现出细胞间质性肺炎和纤维化间质性肺炎的混合肺部病理学改变，且组织病理学分析显示SKG-ILD最类似于非特异性间质性肺炎（nonspecific interstitial pneumonia，NSIP）病理模式，但SKG-ILD本质上是高度反复无常且异质的，并具有不可预测的炎症和纤维化病理现象。（2）佐剂性关节炎（adjuvant arthritis， AA）模型：Song等［4］发现AA模型可自发诱导肺纤维化和炎症性肺病变，似乎也诱导了NSIP，但AA大鼠的肺部病理功能尚未进行正式的病理学评估。（3）胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis， CIA）模型（佐剂中加入少量牛II型胶原）：D1CC转基因小鼠在CIA首次免疫6个月后可诱导肺部自发间质性肺炎伴纤维化及新合成弹性纤维的沉积，然而在CIA诱导的
DBA/1小鼠中未发现间质性肺炎，但可在严重的RA 中发现［5］。（4）肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）转基因小鼠模型：TNF转基因小鼠亦可自发为ILD，表现为血管周围和间质炎性浸润［6］。由此可知，在已知的RA-ILD模型中，似乎所有模型RA-ILD 的发病率具体情况不明，且RA-ILD模型纤维化的证据有限，故目前尚无一个动物模型可以模拟人类RA-ILD的病理特征。因此本课题开展RA-ILD模型的构建和评估，为研究RA-ILD的发病机制及识别措施提供理想动物模型。
材料和方法
1　实验动物
SPF级雌性SD大鼠24只，5~6周龄，体质量130~150 ｇ，由湖南中医药大学SPF级动物实验中心提供，许可证号SCXK（湘）2019-0004，本动物实验经湖南中医药大学动物伦理委员会批准，批准号为：LLBH-202103090006。
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2　实验试剂
免疫级牛II型胶原（Immunization Grade Bovine Type II Collagen；货号20021）购自Chondrex；弗氏完全佐剂（Freund´s complete adjuvant，FCA；货号SA-F5881）购自Sigma；冰醋酸（批号20131026）
购自湖南汇虹试剂有限公司；博来霉素（bleomycin，BLM；Zeocin®；货号Z8020）购自Solarbio；标康数显卡尺购自武汉京东德瑞贸易有限公司；水合氯醛（批号Q/ 12HB 4218-2017）购自天津市科密欧化学试剂有限公司；钠（批号57-30-7）购自上海源叶生物科技有限公司；4%多聚甲醛（批号2275）购自Biosharp；甲泼尼龙片（批号JP200108a）购自湖南中医药大学第一附属医院；通用二步法试剂盒（批号PV-9000）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；白细胞介素22（interleukin-22，IL-22）抗体（批号BS-2623R）购自Bioss；基质金属蛋白酶7（matrix metallo‑proteinase-7， MMP-7）抗体（批号AF0358）购自Affini‑ty；类风湿因子（rheumatoid factor， RF）、C反应蛋白（C-reactive protein， CRP）、TNF-α、抗环瓜氨酸肽抗体（anti-cyclic citrullinate peptide antibody， Anti-CCP-Ab）、MMP-7和转化生长因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）ELISA试剂盒（批号分别为CK-E30575、CK-E30078、CK-E31063、CK-E38004、CK-E35287和CK-E31073）购自上海酶联生物科技有限公司。
3　实验方法
3.1　动物造模及分组　SPF级24只SD大鼠适应性喂养后，随机取8只作为对照组，其余SD大鼠分别在右足底皮垫下、尾根部、尾背部处和背部注射总量0.5 mL已配制的CIA混合剂（20 mg牛II型胶原加入10 mL 0.1 mol/L冰醋酸中配成浓度为2 mg/L溶液，并放置4 ℃冰箱中摇床过夜12 h后与10 mL FCA等量混合，乳化至油包水状态，使其含有胶原量为1 g/ L）进行首次RA免疫造模，此时记为第0天（day 0， d
0）；d 7后再次于大鼠背部、尾根部和尾背部注射总量0.3 mL的CIA混合剂进行第2次RA免疫造模。第2次免疫后1 d（即d 8）随机取8只为RA组，其余8只CIA大鼠用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉后仰卧固定在鼠板上，使用宠物修毛器推剪颈部毛发并消毒皮肤，无菌操作下颈中作0.5~1 cm纵形切口，用镊子逐层剥离各组织暴露气管，用1 mL注射器刺入气管，气管内快速推注BLM （5 mol/kg）灭菌水溶液0.5 mL进行肺纤维化造模，此为RA-ILD组，立即拔出针头，保持大鼠直立体位旋转0.5~1 min，使药均匀到达两侧肺部，缝合皮肤，置于鼠笼内，待
大鼠麻醉苏醒后常规饲养。具体模型构建流程见图1。
3.2　动物取材　构建为RA-ILD 4周后，取材前1 d 大鼠禁食不禁水8 h，d 37时用1.5%钠（45
mg/kg）腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血收集血液，静置30 min离心取血清，用于ELISA检测。手术剪刀剥离大鼠膝关节皮肤，切断关节周围韧带，止血钳钳住髌骨上韧带由上往下剥离髌骨，暴露滑膜组织，手术切刀取出滑膜组织，放入2 mL 4％多聚甲醛中固定，观察组织病理学。同时，迅速分离双肺，取左肺下叶放入5 mL 4％多聚甲醛中固定，用于HE、Mas‑son染及免疫组化检测；另取部分肺组织置于−80 ℃冰箱中保存，用于后续Western blot检测。
3.3　大鼠体质量和关节炎评分　于首次RA免疫（即d 0）及每隔7 d记录大鼠体质量并进行关节炎评分。关节炎评分标准为：0分，正常，无皮肤发红、肿胀；1分，轻度踝关节或部分脚趾红肿；2分，踝
关节至跗骨轻度红肿；3分，踝关节至跖骨中度红肿；4分，整个踝关节、足部和全部脚趾严重红肿或关节强直、畸形。
3.4　大鼠血清RF、Anti-CCP-Ab、CRP、TNF-α、MMP-7和TGF-β1含量的检测　ELISA测定大鼠血清RF、Anti-CCP-Ab、CRP、TNF-α、MMP-7及TGFβ-1的含量。按说明书操作，用酶标仪测量各孔吸光度。3.5　大鼠滑膜和肺组织的HE和Masson染　石蜡包埋切片；70 ℃烤片5 min；放置二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min脱蜡；依次置于100%（Ⅰ、Ⅱ）、95%、85%和75%乙醇中各5 min；蒸馏水浸洗5 min×3次；分别进行HE染和Masson染；70%、80%、90%和100%乙醇各10 s脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min透明；中性树胶封片；置于显微镜下观察。
3.6　大鼠RA-ILD发病情况评判　
依据大鼠滑膜和Figure 1.　Construction of rat rheumatoid arthritis （RA）-associ‑ated interstitial lung disease （RA-ILD） model. black
arrows on day 0 and day 7： collagen-induced arthritis
（CIA） immunization （day 0： the first CIA immuniza‑
tion； day 7： the second CIA immunization）； grey ar‑
row on day 8： bleomycin was injected intratracheally.图1　大鼠RA-ILD模型构建情况
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肺组织HE染及肺组织Masson染结果评判RA-ILD发病情况。评判标准：滑膜HE染、肺组织HE 染及肺组织Masson染结果均为阳性判断为RA-ILD模型成功建立。
3.7 免疫组织化学染测定MMP-7和IL-22的表达水平石蜡切片脱蜡后放于无水乙醇中浸泡3 min×3次，95%和75%乙醇中浸泡各3 min；柠檬酸钠缓冲液（pH 6）中煮沸15 min进行抗原修复，内源性过氧化
物酶阻断剂室温孵育10 min阻断内源性过氧化物酶，滴加Ⅰ抗（MMP-7和IL-22抗体），37 ℃孵育60 min，先后滴入反应增强液、增强酶标兔IgG聚合物室温孵育20 min，滴加DAB显液室温孵育6 min，苏木素染液中复染20 s，脱水、透明、封片，显微镜下采集图片，数码医学图像分析系统分析MMP-7和IL-22阳性目标平均吸光度。
3.8　Western blot检测MMP-7和IL-22的表达水平　把0.1 g肺组织放入含1% PMSF的RIPA裂解液，4 ℃裂解20 min，4 ℃、14 000 r/min离心10 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。各组取50~100 μg总蛋白于12% SDS-PAGE分离，将蛋白转移至PVDF膜，用含5%牛血清白蛋白的TBST封闭60 min，Ⅰ抗（MMP-7和IL-22抗体）在4 ℃条件下孵育过夜，再室温孵育Ⅱ抗1 h，显影后分析目标蛋白条带的相对灰度值。
4　统计学处理
实验数据通过SPSS 26.0软件进行处理。计数资料采用率或构成比来描述，组间对比时采用χ2检验。计量资料以均数±标准差（mean±SD）描述。正态分布资料多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法；不符合正态分布的资料则采用Kruskal-wallis H检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1　各组大鼠体质量情况
与对照组相比，d 0、d 7、d 14、d 21和d 28时RA 组和RA-ILD组大鼠体质量无显著差异，d 35时RA 组和RA-ILD组大鼠体质量均显著降低（P<0.05），见图2。
2　各组大鼠关节炎评分情况
与对照组相比，d 7、d 14、d 21、d 28和d 35时，RA组和RA-ILD组关节炎评分均显著升高（P< 0.05），见图3。
3　各组大鼠血清RF、Anti-CCP-Ab、CRP、TNF-α、MMP-7和TGF-β1含量
构建RA-ILD模型4周后（d 37），与对照组相比，RA组和RA-ILD组大鼠血清RF、Anti-CCP-Ab、CRP、TNF-α、MMP-7和TGF-β1含量均显著升高（P< 0.05）；与RA组相比，RA-ILD组血清Anti-CCP-Ab和TNF-α含量均显著升高（P<0.05），见图4。
4　各组大鼠滑膜及肺组织染结果
构建RA-ILD模型4周后，滑膜HE染显示，对照组大鼠膝关节滑膜周围无炎性细胞浸润；与对照组相比，RA组和RA-ILD组大鼠膝关节滑膜可见大量炎性细胞浸润和滑膜增生，滑膜缺损，甚则血管翳形成。肺组织HE染显示，对照组大鼠肺组织肺泡结构正常、大小均匀，未见明显炎性细胞浸润，Mas‑son染无明显蓝胶原纤维沉积；与对照组相比，RA-ILD组和RA组肺部出现明显肺泡结构紊乱，
肺泡间隔增宽，肺泡壁增厚，部分肺气肿，细支气管上皮细胞脱落，大量炎性细胞渗出，Masson染观察到明显的蓝胶原纤维沉积及纤维灶形，尤以RA-ILD 组更加明显且更加稳定。见图5
。
Figure 2.　Body weight changes of the rats in each group. Mean±SD. n=8.*P<0.05 vs control group.
图2
　各组大鼠体质量变化
Figure 3.　Arthritis scores of the rats in each group. Mean±SD. n=
8.*P<0.05 vs control group.
图3　各组大鼠关节炎评分
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5　各组大鼠RA-ILD发病率
构建RA-ILD 4周后，RA组大鼠RA-ILD发病率为50%，RA-ILD组大鼠RA-ILD发病率为100%，与RA组相比显著升高（P<0.05）
。
， TNF-*P<
0.05 vs control group；#P<0.05 vs RA group.
图4　各组大鼠血清RF、Anti-CCP-Ab、CRP、TNF-α、MMP-7和TGF-β1
含量
Figure 5.　Pathological changes of synovial and lung tissues of the rats in each group.
图5　大鼠滑膜及肺组织病理变化
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