慢性重型乙肝病人血清ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体
ＥＬＩＳＡ检测方法的建立及应用
吕维红１张旋２。王梅珍１
１（青岛市市立医院）
２（山东青岛卫生学校）
【摘要】目的：建立血清ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体ＥＬＩＳＡ检测方法，并探讨其在慢性重型乙肝病人发病机制研究中的意义。方法采用多抗体夹心ＥＬＩＳＡ法，检测血清ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体。检测了健康献血员３７例、４１例无症状已肝病毒携带者、４０例慢性乙型重型肝炎及４２例乙肝病毒相关性肝细胞癌患者血清ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体。结果慢性重型肝炎病人血清ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体阳性率显著高于健康对照组、无症状乙肝病毒携带者、乙肝相关性肝细胞肝癌组。结论本研究建立的ＥＬＩＳＡ方法可以较好地检测出血清中的ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体；慢性乙型重型肝炎患者血清中存在ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体。
【关键词】ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体慢性乙型重型肝炎ＥＬＩＳＡ
ＥｓｔａｂｌｉｓｈａｎｄＡｐｐｌｉｆｉｅａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＥＬＩＳＡＭｅｔｈｏｄｉｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓＦａｓ・—ｓＦａｓＬＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓｉｎＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＣｈｒｏｎｉｃＳｅｒｉｏｕｓＨｅｐａｔｉｔｉｓＬｕＷｅｉｈｏｎ９１ＺｈａｎｇＸｕａｎ２ＷａｎｇＭｅｉｚｈｅｎｌＱｉｎｇｄａｏＭｕｎｉｃｉｐａｌＨｏｓｐｉｔａｌＱｉｎｇ－ｄａｏ２６６０１１
【Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｔｏｄｅｔｅｃｔｓＦａｓ—ｓＦａｓＬｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓｉｎｓｅｒｕｍ，ａｎｄｓｔｕｄｙｉｔ’ｓｅｆｆｅｃｔｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｃｈｒｏｎｉｃｈｅｐａｔｉｔｉｓＢ．ＭｅｔｈｏｄｓｓＦａｓ—ｓＦａｓＬｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｅｗＥＬＩＳＡｍｅｔｈｏｄｉｎｆｏｕｒｇｒｏｕｐｓ，４１ＡｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃＨＢｓＡｇｃａｒｒｉ—ｅｒｓ，４０ｃａｓｅｓｏｆｃｈｒｏｎｉｃｓｅｒｉｏｕｓｈｅｐａｔｉｔｉｓＢａｎｄ４２ｃａｓｅｓｏｆＨＢＶｒｅｌａｔｅｄＨＣＣ，３７ｈｅａｈｈｙｂｌｏｏｄｄｏｎｏｒａｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆｓＦａｓ—ｓＦａｓＬｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓｉｎｃｈｒｏｎｉｃｓｅｒｉｏｕｓｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｇｒｏｕｐｗａｓｈｉｇｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｔｈａｔｏｆｏｔｈｅｒ３ｇｒｏｕｐｓ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅＥＬＩＳＡｍｅｔｈｏｄｗｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｉｓ
ｓｔｕｄｙｃａｌｌｄｅｔｅｃｔｔｈｅｓＦａｓ—ｓＦａｓＬｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔｓｉｎｓｅｒｕｎｌ．Ｔｈｅ
ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔｓｍａｙｐｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎｈｅｐａｔ—ｉｃａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｎｅｃｒｏｓｉｓ，ａｎｄｍａｙｂｅａｐｐｌｉｅｄａｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｃｌｕｅｉｎｄｉａｇｎｏｓｉｎｇｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｇｎｏｓｉｓｉｎｃｈｒｏｎｉｃｓｅｒｉＯＵＳｈｅｐａｔｉｔｉｓＢ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓＣｈｒｏｎｉｃｓｅｒｉｏｕｓｈｅｐａｔｉｔｉｓＢＥＬＩＳＡ
慢性乙型重型肝炎的发生是多因素综合作用的结果，其
中Ｆａｓ抗原与Ｆａｓ配体的交联可诱发细胞凋亡功能，对该病
免疫性损伤的发生、发展及调节起了重要作用…１。目前，国
内外的研究都集中在膜性Ｆａｓ／ＦａｓＬ及可溶性Ｆａｓ方面，未见
有关ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体检测方法及探讨其变化规律的研究
的报道。本文建立了酶联免疫吸附法检测ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体，并对健康人、无症状乙肝病毒携带者、慢性乙型重型肝炎、乙肝相关性肝细胞癌患者进行了检测，现报告如下。
１材料与方法
１．１标本来源选用我院１９９９—２００２年住院病人，慢性乙
型重型肝炎组４０例，门诊病人无症状乙肝病毒携带组４１例，
诊断均符合２０００年９月（西安）第七次全国传染病寄生虫病
学术会修订的病毒性肝炎防治方案诊断标准１２］；乙肝相关肝
细胞癌组４２例，诊断符合２００１年９月第八次全国肝癌学术＊青岛市自然科学基金资助课题（课题编号：青科计字［１９９９１２９３号会议“原发性肝癌的临床诊断与分期标准”Ｌ３１；另选用３７例健康献血员作为正常对照。所有患者未前取全血５ｍｌ，分离血清于一７０。Ｃ冻存备用。
１．２主要试剂
羊抗鼠多克隆抗体：Ｐｒｏｍｅｇａ公司；羊抗兔ＩｇＧ—ＨＲＰ：ＳｏｕｔｈｅｍＢｉｏｔｅｃｈＡ
ｓｓｏｃｉａｔｅｓ．Ｉｎｃ；纯化鼠抗人ｓＦａｓ单克隆抗体：ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓｐｈａｒｒｎｉｎｇｅｎ；纯化兔抗人ｓＦａｓ—Ｌ单克隆抗体：ＢＤｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓｐｈａｎｎｉｎｇｅｎ．
１．３实验方法
１．３．１设计原理ＥＬＩＳＡ检测ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体的原理如图所示。首先以羊抗鼠多克隆抗体包被ＥＬＩＳＡ反应板，加入鼠抗人ｓＦａｓＬ单抗，形成抗人ｓＦａｓ包被板并封闭；加入待测血清后再加入兔抗人ｓＦａｓＬ单抗，如果待测血清中含有ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体，则被固定在反应板上，当加入ＨＲＰ标记的羊抗兔ＩｇＧ和反应底物后，出现显反应。
图１ＥＬＩＳＡ检测ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体原理示意图１．３．２双抗体夹心ＥＩＬＳＡ法检测特异性抗体操作步骤
适于抗体量少又无纯化抗原时特异性抗体的检测，可用于针对同一抗原的不同单克隆抗体进行表位作图。
（１）用多道移液器，每孔中加５０９ｌｌ：１０００羊抗鼠多克隆抗体，并轻弹或摇动平板以使抗原均匀分布，将包被的酶标板用塑料保鲜膜封好，３７℃放置２小时。
（２）封闭液封闭，洗板，加５０ｔＡｌｓｔ馏，／，ｌｌｌ的鼠抗人ｓＦａｓ单克隆抗体，３７℃放置２小时。洗板。
（３）加入５０脚待检血清，每个样品平行设立两个检测孑Ｌ。３７。Ｃ放置２个小时。洗板。
（４）加入５０出１５馏／ｒｎｌ兔抗人ｓＦａｓ—Ｌ单克隆抗体，３７。Ｃ放置２小时，洗板。
（５）；０Ｕ入５０出羊抗兔ＩｇＧ—ＨＲＰ，３７０Ｃ放置２小时，洗板。
（６）每孔中加入７５ｍ的二氨基联苯胺溶液，室温放置１小时，在酶标仪４５０ｎｍ光波下读数。最后终止反应。１．３．３结果判定
（１）目测：白背景下观察各孔颜，明显兰为阳性，无为阴性。
（２）酶标仪检测（选波长４５０ｎｍ）：每－ｆＬ）Ⅱｌｌ终止液１滴，用空白孔调零，测定各孔ＯＤ值。临界值（Ｃ．Ｏ．）＝２．１×阴性对照ＯＤ值，样本ＯＤ值Ｓ／Ｃ．Ｏ．≥１．１，判为阳性。
１．３．４统计学分析
用ＳＰＳＳ统计软件包，根据数据分布特点及处理要求，计数资料比较用Ｘ２检验。
２结果
以本方法检测了乙病毒携带者、慢性重型肝炎、乙肝相关性肝癌病人以及健康人血清中的ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体，结果见表１。
表１乙肝相关疾病不同组别血清ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体阳性率比较３讨论
近年来在对病毒性肝炎的肝细胞凋亡及凋亡调控基因表达在肝炎发病机制及癌变机制的研究中发现，Ｆａｓ—ＦａｓＬ系统在免疫介导的肝细胞凋亡中起着重要作用。Ｆａｓ—ＦａｓＬ系统可以存在于某些细胞膜上，或溶于血清中（ｓＦａｓ，ｓＦａｓＬ）。ＣＴＬ、ＮＫ细胞膜上同时表达Ｆａｓ和ＦａｓＬ，表达于膜上的ＦａｓＬ与靶细胞膜上表达的Ｆａｓ分子结合，可传递细胞凋亡信息，导致靶细胞的凋亡，而ＣＴＬ、ＮＫ细胞膜上的Ｆａｓ分子也可与ＦａｓＬ结合引起自身凋亡，下调免疫反应，以至于不能及时清除变异细胞，最终导致细胞癌变ＨＪ。
如果Ｆａｓ基因转录过程ｒｎＲＮＡ剪切方式发生改变，则可编码合成跨膜区不完整或缺失的可溶性Ｆａｓ（ｓＦａｓ），它可竞争性阻断膜性Ｆａｓ与ＦａｓＬ结合，而抑制凋亡。ＦａｓＬ也可脱落或被分泌至细胞外，成为可溶性活性分子（ｓＦａｓＬ）。ｓＦａｓＬ可以通过以下两种途径诱导肝细胞凋亡：（１）与肝细胞膜上Ｆａｓ结合，诱导肝细胞凋亡；（２）与ｓＦａｓ结合，阻断了ｓＦａｓ与免疫活性细胞ＦａｓＬ结合的能力，从而使免疫活性细胞膜上的ＦａｓＬ与肝细胞膜上的Ｆａｓ更多的结
合，从而诱导肝细胞凋亡。值得一提的是，免疫活性细胞膜上的ＦａｓＬ增多同时可以与免疫活性细胞膜上的Ｆａｓ结合，下调免疫反应。据推测前者作用占优势，所以表现出的结果是肝细胞凋亡增加［５，６３。
由于ｓＦａｓ、ｓＦａｓＬ都可以于血清中检测出，而血清中是否存在ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体，以及该复合体的存在有何意义目前国内外文献均无报道。因此我们首次建立了血清ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体的ＥＬＩＳＡ检测方法，并对健康人、无症状乙肝病毒携带者、慢性乙型重型肝炎、乙肝相关性肝细胞癌患者进行了检测。结果显示，慢性乙型重型肿炎患者血清中ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体的阳性率明显高于无症状乙肝病毒携带者、乙肝相关性肝细胞肝癌病人和正常人。据此推测，ｓＦａｓ与ｓＦａｓＬ结合形成ｓＦａｓ—ｓＦａｓＬ复合体，阻断了ｓＦａｓ与免疫活性细胞膜上ＦａｓＬ的结合，从而使后者更多地与肝细胞膜上的Ｆａｓ结合，诱导肝细胞的凋亡，导致肝功能的衰竭。
参考文献
ｘ２＝１１４．７５，Ｐ＜０．００１，组间比较慢性重型肝炎组与健康
对照组、无症状乙肝病毒携带者、乙肝相关性肝细胞肿癌组１ＨｉｒａｍａⅫＮ．Ｈａｙａｓｈｉ
Ｎ．ＫａｔａｙａｎｒａＫ，。ｔａＩ．Ｉｍｍｏｎｅｈｉｓｔｏｃｈｅｎｆ，。ａｌｄｅｔｅｅ．
相比差异有极显著性意义。ｔｉｏｎｏｆＦａｓ
ａｎｔｉｇｅｎｉｎｌｉｖｅｒｔｉｓｓｕｅｓｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｈｒｏｎｉｃｈｅｐａｔｉｔｉｓ
Ｃ．
・４０・ＱｉｌｕＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅＳｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，２００３，Ｖｏｌｌ４，Ｎｏ．３齐鲁医学检验２００３年第１４卷第３期
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２００１年９月６辛绍杰，陈黎明，张战红，等，乙型肝炎患者血清可溶性Ｆａｓ检测的４ＪｏｄｏＳ，ＫｏｂａｙａｓｈｉＳ，ＮａｋａｊｉｍａＹ，ｅｔａ１．Ｅｌｅｖａｔｅｄｓｅｎｌｍｌｅｖｅｌｓｏｆｓｏｌｕｂｌｅ临床意义．中华传染病杂志，１９９９，１７：１３２～１３３．Ｆａｓ／Ａｐ０—１（ＣＤ９５）ｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒＣａｒｃｉｎｏｍａ．ＣｌｉｎＥｘｐ
辛伐他汀对冠心病高脂血症患者Ｃ反应蛋白的影响
颜卫荣王晓玲王晓俐
（山东省立医院，济南２５００２１）
辛伐他汀（商品名：舒降之）是３一羟基３一甲基戊二酰辅酶Ａ（ＨＭＧ—ＣｏＡ）还原酶抑制剂，临床上除可有效地降低总胆固醇（ｒＩ℃）、低密度胆固醇（ＬＤＬ—Ｃ）外，还有抗炎的特性，能降低
Ｃ反应蛋白（ＣＲＰ）的水平。现把舒降之对冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）患者发病过程中血浆Ｃ反应蛋白（ＣＲＰ）的变化进行观察，报告如下。
１病例与方法
１．１病例：冠心病且伴有高脂血症患者８４例，诊断符合国际心脏病学会和世界卫生组织缺血性心脏病的诊断和命名标准，停服调脂药２周，分测两次血脂，如两次血清总胆固醇（ＴＣ）平均＞４．６８ｍｍｏｌ／１者入选。其中，男６６例，女１８例；年龄（５８．７±１０．４）岁；稳定型心绞痛２８例，不稳定型心绞痛２７例，急性心肌梗死２９例；均除外合并心肌炎、心肌病、心内膜炎、风湿性心脏病、结缔组织病、肿瘤及肝硬化等。同时选择３０例正常人作对照组，男２２例，女８例；年龄（５４．０±１１．２）岁。
血清检测reactive是阴还是阳１．２服药方法：在常规冠心病药物基础下给予辛伐他汀２０ｍｇ，每日一次口服，连服１２周。
１．３检测方法：取受试者清晨空腹静脉血分别与前、后检测ＣＲＰ。ＣＲＰ的测定采用美国ＢＥＣＫＭＡＮ．ＡＲＲＡＹ３６０ＣＥ全自动免疫特种蛋白分析仪，利用散射光比浊法测定ＣＲＰ含量，正常值＜８０００／ｔｇ／Ｌ。
１．４统计学方法：数据以均数±标准差（Ｘ±Ｓ）表示，用ｔ检验比较组间差异。
２结果
冠心病组与正常对照组的ＣＲＰ测定结果见表１。
３讨论
本研究显示，１．稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛及急性心肌梗死患者的ＣＲＰ都明显高于正常人，且从稳定型心绞痛到不稳定型心绞痛，最后发展为心肌梗死的过程中，其水平有逐渐增加的趋势，这与国内外的研究结果是相符的…１，说明ＣＲＰ与冠心病的发生发展密切相关。ＣＲＰ的增加可能是由于动脉本身广泛严重的粥样硬化斑块内的炎症组织损伤所致，可用ＣＲＰ评估心肌损伤的程度及判断预后拉Ｊ。２．经辛伐他汀后，不稳定型心绞痛、急性心肌梗死病人的ＣＲＰ明显降低，具有统计学意义（Ｐ＜０．０１）。说明辛伐他汀除了具有降血脂的作用外，还有降低炎性反应，稳定冠脉斑块作用旧Ｊ。总之，血清ＣＲＰ水平可预测冠心病的严重程度和判断预后情况；对ＣＲＰ水平增高的冠心病人，给予辛伐他汀干预后，可降低ＣＲＰ水平，减少冠心病人的危险因素。
表１冠心病高脂血症患者前、后ＣＲＰ变化（Ｘ±ｓ）
Ｏ．０ｌ
注：与正常对照组比较：＊Ｐ＜０．０１，各组自身前后比较＊＊Ｐ＜
参考文献
ｌＬａｇｒａｎｄＷＫ，ＮｉｅｓｓｅｒＨＷ．Ｃｒｅａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｌｏｃａｌｉａｅｓｗｉｔｈｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｈｕｍａｎｈｅａｒｔｓｄｕｒｉｎｇａｃｕｔｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９７，９５（１）：９７～１０３．
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３ＳｔｒａｎｄｂｅｒｇＴＥ，ＶａｎｈａｎｅｎＨ，ＴｉｋｋａｎｅｎＭＪ．ＥｆｆｅｃｔｏｆｓｔａｔｉｎｓＯｉｌＣ—ｒｅａｃｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎ
ｉｎ
ｐａｔｉｅｎｔｓ
ｗｉｔｈｃｏｒｏｎａｒｙａｒｔｅｒｙｄｉｓｅａｓｅ．Ｌａｎｃｅｔ，１９９９Ｊａｎ９：３５３（９１４７）：１１８～１１９．

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